主题： NMT在水胁迫（水淹胁迫、涝渍）研究领域的应用成果

2015年3月，香港中文大学张建华与南京土壤所许卫锋合作，在植物领域的知名期刊Journal of Experimental Botany上发表了题为《Involvement of 14-3-3 protein GRF9 in root growth and response under PEG-induced water stress》的研究成果。这是双方实验室合作利用扬格/旭月非损伤微测系统发表的第二篇水胁迫文章。


2012年，合作双方利用NMT检测了拟南芥根部H⁺流速，发现ABA通过调节生长素的运输促进根尖H⁺的分泌来适应水胁迫。此次研究同样以拟南芥作为材料，探索了14-3-3家族的GRF9在调控植物适应水胁迫过程中的作用机制。


实验材料分为野生型（WT）、GRF9缺陷突变组（grf9）以及GRF9超表达组（OE），分别观察了各组样品在正常与水胁迫条件下的长势，并利用非损伤微测技术检测了根部H⁺的流动。在两种条件下，OE组长势均好于WT组，而grf9组长势最差。流速结果显示，GRF9促进了水胁迫条件下，拟南芥根部伸长区、根毛区H⁺的外排。此外，通过OE组观察到GFR9有助于地上部分的有机物向根部分配。结合嫁接实验数据，表明在水胁迫条件下，GRF9通过激活质膜H⁺-ATPase、促进根部生长区域分泌H⁺，并且加强地上部分有机物向根部分配，从而调节植物应对水胁迫。这一结论也合理解释了水胁迫条件下相比于地上部分，根部生长更为旺盛的原因。


这是许卫锋教授在2012-2015四年间，利用非损伤微测技术发表的第七篇SCI文章，总影响因子已达35.9。许卫锋教授目前在拟南芥水胁迫、磷、盐碱胁迫研究上，已建立了完善、有效的NMT实验体系，已成为利用NMT研究H⁺-ATPase调控相关基因名副其实的国内第一人。

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在植物适应土壤水胁迫的过程中，维持根的生长非常重要。2013年初，香港中文大学张建华实验室和中国科学院南京土壤研究所施卫明实验室通过非损伤微测技术等多种方法证实了植物为了保持根在中度水分胁迫下的生长，需要生长素激活根尖质子的分泌参与ABA调节抵抗水胁迫的过程。


文中使用水稻和拟南芥为材料，用-0.47 MPa 的PEG进行水胁迫处理后，检测了根尖的ABA积累，生长素运输和质膜H⁺-ATPase的活性（H⁺流速或称质子流速），以及初生根的长度和根毛的密度。结果发现中度水胁迫增加了根尖ABA的积累和生长素的运输，ABA参与了根尖生长素运输的调控，生长素激活了质膜H⁺-ATPase，使更多的质子释放用来适应水胁迫，而根尖的质子分泌对保持和促进初生根的伸长和根毛的发育是必需的过程。


这项研究从ABA调节植物耐水胁迫的作用入手，发现了生长素参与了水胁迫的调节，最终通过促进质子的分泌来维持水胁迫下根的生长。进一步说明激素之间的相互激活对适应环境胁迫具有重要意义。

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半水生双子叶植物Rumex palustris在水淹时通过叶柄的伸长避开水淹，叶柄的伸长需要细胞壁的松弛，细胞壁的松弛需要通过特定蛋白的调节，因此研究细胞松弛蛋白的调节作用对于植物避开水淹至关重要。松弛蛋白是水淹胁迫下信号转导途径中的重要蛋白，而植物体内乙烯含量的升高是躲避水淹环境的主要信号。当前的研究旨在揭示水淹胁迫下细胞壁酸化以及激素调节作用，以及从mRNA和蛋白水平阐明水淹胁迫下与叶柄伸长有关的细胞壁松弛蛋白活性的动力学特征和激素调节作用。


荷兰的科学家使用非损伤微测技术测定了水淹胁迫下叶柄H⁺的外流，阐述了松弛蛋白的转录作用。发现在水淹下乙烯能够促进叶柄伸长以及细胞壁膨胀。首先，乙烯能够加快H⁺外流，导致质外体空间酸化；其次，乙烯能够作为信号分子向上调控松弛蛋白基因中的RpEXPA1。水淹胁迫下的反应能够在胁迫解除后恢复。叶柄的不断伸长通过乙烯控制H⁺的外流来加速，水淹胁迫下植物可改变茎部的结构，使茎部伸长，并产生新生叶片。形态上的变化可以快速增加植株高度，使叶片迅速伸展到水面之上，促进空气与植物体间的气体交换。


乙烯是对淹水胁迫反应最敏感的激素之一，R.palustris在水淹胁迫下叶柄伸长与乙烯信号网络途径有关。本研究利用非损伤微测技术深入揭示了乙烯在水淹胁迫下细胞壁的酸化和H⁺外流的作用及相互关系。

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淹水的主要危害之一是造成土壤缺氧，导致厌氧微生物大量积累有毒物质。了解淹涝对植物生长影响的机理，揭示其适应机制，从而合理选择和定向培养耐涝品种，减轻淹涝对农业生产的危害有重要的意义。目前的研究集中在改善耐涝植物对氧气保持和运输方面，而植物对次生代谢物的抗性研究还没有一个可靠的研究方法。


澳大利亚的科学家Shabala使用非损伤微测技术（MIFE）检测两种不同基因型的大麦NN和TX根部次生代谢产物对细胞膜离子转运过程的影响。水淹敏感的的品种“Naso Nijo”被三种一元羧酸（甲酸、乙酸、丙酸）和三种石碳酸（苯甲酸、2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸）处理都能引起稳定的K⁺外流，并伴随着H⁺内流，但是在耐涝品种TX的根细胞中没有K⁺的显著改变。石碳酸处理增加了Ca²⁺内流，另一些代谢物引起了Ca²⁺的外流。长期处理（24h）后所有的代谢物引起了的K⁺吸收的显著减少。一元羧酸处理24h后H⁺由外流转变成内流，三种石碳酸对H⁺没有显著影响。基于药理学实验和膜电势的结果，提出了一个解释次级代谢物对膜转运活性影响的模型。这项研究发现植物对次级代谢物的忍耐在育种当中是一个非常有用的特征。


大麦抗涝基因不仅赋予根解剖差异，而且可在很大的程度上减少次生代谢产物对膜在运输过程中的不利影响，特别是改善K⁺的保留情况。这方面的研究将给以后的研究和育种提供新的方法。

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1）亚精胺提升种子耐水淹胁迫能力
Spermidine Enhances Waterlogging Tolerance via Regulation of Antioxidant Defence, Heat Shock Protein Expression and Plasma Membrane H⁺-ATPase Activity in Zea mays（Journal of Agronomy and Crop Science，F2014-018）