主题： NMT在重金属胁迫（Cd镉胁迫）研究上的应用

华中农业大学胡承孝教授，以两个品种的油菜作为研究材料，利用生理以及遗传学实验手段，研究了包括Cd在油菜植株内的吸收及转运等过程。


研究发现，L351品种同L388品种相比，前者地上部分的Cd积累更多，而根部恰好反之。研究者利用非损伤微测技术（NMT），检测了样品根部根毛区域的Cd²⁺流速。结果显示，L351根部吸收Cd²⁺的速率同L388相比，并无优势。反而是L388根部吸收Cd²⁺的速率比L351高出68%。研究同时使用了Cd浓度检测技术，观察了油菜样品根部Cd的吸收动力学。检测结果表明，L351木质部转运Cd的能力要明显强于L388。正是由于L351较强的Cd转运能力，才致使地上部分Cd含量高于根部吸收Cd²⁺能力更强的L388。此外，基因表达检测结果显示，油菜根部吸收Cd的能力同IRT1相关，而木质部转运Cd的能力则是由HMA2以及HMA4决定的。


至此，研究表明油菜地上部分的Cd含量与根部吸收Cd的能力并无直接联系，而是一定程度上取决于木质部的Cd转运能力。

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杨树细胞内γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的过表达可以引起叶片谷胱甘肽浓度的升高，预示着其具有镉修复的潜力。然而杨树对Cd²⁺的吸收能力与H⁺/Ca²⁺的流动、杨树的镉耐受能力之间的关系，及其内在的分子生理机制却鲜有研究。


本研究检测了野生型与转基因杨树在Cd²⁺吸收能力、镉耐受能力以及Cd²⁺转运解毒相关基因表达量上的差异。通过非损伤微测技术（NMT）检测发现，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶超表达组与野生型相比，具有更强的Cd²⁺吸收能力，Cd²⁺转运、解毒相关基因的转录水平上调，同时，前者地上部分聚集了更多的镉。这一结果表明，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶超表达品种能更好地耐受镉胁迫，并且这种耐受能力可能与谷胱甘肽介导的Cd²⁺转运、解毒相关基因的表达上调有关。


这是罗志斌实验室使用非损伤微测技术发表的第三篇Cd²⁺文章，系统的建立了植物响应重金属机制研究的活体实验体系。

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硅（Si），这一地壳中含量仅次于氧的元素，其对大多数高等植物而言，没有特别重要的意义。但2000年有报道称，Si可以提升植物对生物/非生物胁迫的抗性，其中Si可以抑制重金属镉（Cd）对水稻的毒害尤为引人注目。王荔军课题组通过前期的研究表明，Si可以与水稻细胞的细胞壁结合，形成一种 [Si-wall matrix]Cd的结构，从而抑制水稻细胞对Cd²⁺的吸收。


本文同样以水稻悬浮细胞作为研究材料，在含有/不含有1 mM硅酸的培养液中培养一段时间后，利用非损伤微测技术（NMT）在不同浓度的Cd²⁺溶液中检测发现，Si预处理组相较于对照组，Cd²⁺吸收速率明显降低，这与先前的研究结果一致。研究还观察了Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺分别存在的条件下，Si预处理组与对照组对Cd²⁺的吸收情况。结果显示，加入Mn²⁺、Co²⁺对Cd²⁺的流速并无影响，而加入Cu²⁺后，两组水稻细胞Cd²⁺的吸收速率均增加数倍。RT-qPCR结果表明，加入Cu²⁺后，Cd²⁺转运相关基因Nramp5表达显著上调。


这一研究发现表明，Cd²⁺的吸收转运会受到其它二价金属离子的影响。其机制可能是Cu²⁺促使了Nramp5基因的表达，从而导致Cd²⁺吸收速率增大。此外Cd²⁺借用Cu²⁺通道、Cu²⁺激活Ca2⁺通道等，均是Cd2+吸收增加的潜在机制。NMT已经成为该课题研究的必要技术。



左图：-/+Si处理时，水稻悬浮细胞Cd²⁺的流速。黑线，-Si+Cd；红线+Si+Cd。正值表示外排，负值表示内流。；右图：瞬时加入30 μM Cu²⁺后 ，水稻悬浮细胞Cd²⁺的流速。

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重金属镉离子（Cd²⁺）的毒性机制是近年来生命科学、环境科学等领域的研究热点。Cd²⁺影响植物对营养物质的吸收、转运和利用。但是，Cd²⁺毒害的作用机制还不清楚。


2012年，南京大学盐生植物实验室的研究成果“Cadmium Impairs Ion Homeostasis by Altering K⁺ and Ca²⁺ Channel Activities in Rice Root Hair Cells”在《Plant, Cell & Environment》（2010 IF 5.145）杂志发表，揭示了Cd²⁺造成毒害的重要机制。


这本文使用非损伤微测技术（NMT）等手段深入研究了Cd²⁺对水稻根毛细胞Ca²⁺、K⁺平衡的影响，发现Cd²⁺能诱导细胞的去极化，阻碍细胞对Ca²⁺和K⁺的吸收，减少根内K⁺的净含量。这是Cd²⁺破坏植物离子平衡的直接证据。


这一研究直接而简洁地证实了Cd²⁺通过改变Ca²⁺和K⁺的变化而影响胞内的离子平衡，并伴随着H⁺的改变。使用NMT进行的活体测定，是研究进出细胞离子的关键手段，揭开了离子之间相互作用破坏胞内的离子平衡，进而产生离子毒害。

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外生菌根是寄主根部与某些真菌形成的共生组织，并可以增强寄主植物对Cd²⁺的耐受能力，但其生理学和分子学机制尚不明确。


本研究以卷缘桩菇菌与银灰杨根部形成的外生菌根为研究对象，揭示木本植物的外生菌根对寄主镉耐受能力的影响。有菌根银灰杨与无菌根银灰杨经过镉处理5min后对比，通过非损伤微测（NMT）技术检测发现，前者根尖有更多的Cd²⁺内流且H⁺外排更强，H⁺-ATP抑制剂处理后，后者Cd²⁺吸收趋于消失，而有菌根银灰杨根尖对Cd²⁺吸收下降较少。


实验结合气体交换测量、基因转录水平检测，证明外生菌根提升了寄主对Cd²⁺的吸收能力，可能与增加了根部体积以及与Cd²⁺吸收、运输相关基因的超表达有关，此外通过提升镉解毒能力、营养与碳水化合物水平，从而提高了银灰杨对Cd²⁺的耐受能力，这为植物修复提供了新思路。[/size]

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（1）Different responses of low grain-Cd-accumulating and high grain-Cd accumulating rice cultivars to Cd stress
（Plant Physiology and Biochemistry，C2015-020）

（2）Nitric oxide modulates cadmium influx during cadmium-induced programmed cell death in tobacco BY-2 cells（Planta，C2010-005）

（3）Overexpression of Populus euphratica xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase gene confers enhanced cadmium tolerance by the restriction of root cadmium uptake in transgenic tobacco（Environmental and Experimental Botany，C2014-014）

（4）Inhibition of cadmium ion uptake in rice (Oryza sativa) cells by a wall-bound form of silicon（New Phytologist，C2013-019）

（5）Non-invasive microelectrode cadmium flux measurements reveal the spatial characteristics and real-time kinetics of cadmium transport in hyperaccumulator and nonhyperaccumulator ecotypes of Sedum alfredii（Journal of Plant Physiology，C2013-001）

（6）Net cadmium flux and accumulation reveal tissue-specific oxidative stress and detoxification in Populus × canescens（Physiologia Plantarum，C2011-006）

（7）Disarrangement of actin filaments and Ca2+ gradient by CdCl2 alters cell wall construction in Arabidopsis thaliana root hairs by inhibiting vesicular trafficking（Journal of Plant Physiology，C2011-005）

现在研究重金属的人越来越多了，而且国家经费投入巨大，要想脱颖而出，除了创新思路，好的技术和抢占先机的意识也很重要！我就遇到过一个老师辛辛苦苦马上要做完的成果，却被别人抢先发了

从近期咨询NMT重金属工作站以及Cd2+测试服务的客户数量来看，重金属的相关研究持续走高态势，当然这也可能与NMT的技术特点与此研究方面匹配度较高有一定关系。就目前Cd2+的测试量和文章发表数量的比例来看，未来一段时间，NMT在重金属方面的科研文章会越来越多，可供老师们参考的文献会更丰富，但与此同时，进行相关创新研究的难度也会有所上升。