第22期--烟草花粉管作为离子动力学研究的模型

用离子流技术和荧光蛋白提高胞内外Ca²⁺和H⁺的时空分辨率

图注：通过pHluorin染色的花粉管尖端胞内的H⁺浓度和应用非损伤微测技术测定烟草花粉管尖端的H⁺流。正值为外流，负值为内流。

Ca²⁺和H⁺在花粉管生长、定向伸长及形态形成方面起重要作用，花粉管中分化细胞的伸长需要Ca²⁺和H⁺的浓度梯度的存在。由于百合不易构建稳定的转基因体系，因此并不适合作为分子遗传研究的模式植物，而烟草转基因及细胞生物学方面的研究较为深入，其花粉管也便于获得，因此更适合作为花粉管研究的模式材料。

葡萄牙科学家Feijó和Michard等研究人员用烟草作为实验材料，瞬时表达了pHluorin和黄色Cameleon蛋白作为探针分别用于胞内H⁺和Ca²⁺的比例成像分析，H⁺和Ca²⁺离子流通过非损伤微测技术流获得，并应用傅立叶分解法及连续小波分析法分析花粉管伸长期间离子浓度梯度、离子流及生长速率。结果表明，烟草花粉管尖端存在一个0.4pH单位的梯度，而且花粉管上存在一个亚尖端的碱化区域。胞外质子流振荡大约在10～40pmol·cm^-2·s^-1，花粉管胞内及胞内H⁺振荡存在一个或两个峰，Ca²⁺在花粉管尖端存在一个0.2～1.0uM的离子浓度梯度，振荡周期为1～4min，胞外的Ca²⁺流振荡大约在2～50pmol·cm^-2·s^-1。共聚焦及宽谱显微观察表明，花粉管细胞内的H⁺和Ca²⁺的模式和形状有所差异。

这项研究应用非损伤微测技术和荧光指示蛋白使花粉管H⁺和Ca²⁺的研究精度得以提高，是分子生物学手段与生理检测手段结合研究花粉管的一个范例。

关键词：花粉管(Pollen tube)，钙信号(Calcium signaling)，质子信号(Proton signaling)，细胞分化(Cell polarization)

参考文献：Erwan Michard. et al. Sexual Plant Reproduction, 2008, 21: 169-181

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第21期--H+动力学调控卵子发生

红锥蝽卵子发生过程中胞外H⁺转运动力学

图注：上图是通过非损伤微测技术在卵巢管不同部位不同生长时期检测到的H⁺流的变化情况。正值为外流，负值为内流。

卵子发生在生物体形成过程中非常重要，影响到胚胎的发育以及个体的形成，在这个过程中，H⁺动力学起到一个关键的调节作用，细胞通过H⁺转运维持膜电势和产生跨膜的化学梯度来驱动次级代谢，但是在昆虫滋养型卵母细胞成卵过程中发生的H⁺流的变化和H⁺流引起的pH值变化所起到的调节作用却了解很少。利用“非损伤微测技术”可实现对H⁺流在不同时间和空间的实时监测，从而揭示H⁺流在昆虫滋养型卵母细胞生成过程中所起到的调节作用。

美国Wadsworth中心神经系统失调研究实验室科学家Bjornsson C. S.等采用“非损伤微测技术”对红锥蝽（Rhodnius prolixus）在相同生长部位的不同生长阶段进行胞外H⁺流实时监测发现，卵黄生成中期卵巢管中分离相邻卵泡囊的主茎表现出显著的H⁺外流，而在卵黄生成后期H⁺外流减弱。H⁺外流的现象不仅在主茎生成之前已经产生，而且先于邻近卵泡囊的卵黄生成起始阶段。另外在生成绒毛膜的末端卵泡囊和卵泡囊排卵后也分别检测到了H⁺的外流现象，这揭示了躯体的卵泡上皮细胞控制着H⁺的外流。

该研究通过非损伤微测技术检测昆虫成卵过程中H⁺流的变化，揭示了H⁺流在卵黄生成的起始阶段、内吞、卵泡细胞骨架动力学及滤泡反馈机制调节中的重要作用，跨膜H⁺流可促使胞内pH值的改变。这为昆虫成卵过程的机理研究提供了新颖的思路和方法。

关键词：H⁺, 离子选择电极(ion-selective probe) , 卵子发生(oogenesis)

参考文献：Bjornsson CS, et al. The Journal of Experimental Biology,2004, 207, 2835-2844

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第20期--质膜转运体控制离子平衡

大麦根的质膜转运体控制盐胁迫后的Na⁺/K⁺平衡

图注：不同基因型的大麦在320mM的NaCl处理后表现出了显著差异，盐忍耐型(T)的大麦长势较盐敏感型(S)的好很多。NaCl处理后，T品种的K⁺外流明显低于S品种。施加外源的Ca²⁺，能够有效降低K⁺外流。正直为内流，负值为外流。

植物的耐盐性是一个由遗传、发育、生理，以及植物与环境之间的相互作用引起的多基因性状。胞内的Na⁺/K⁺平衡是植物耐盐性的关键因素，在盐环境中植物会阻止胞内Na⁺的过度积累，维持胞内的K⁺浓度，保持一个合适的胞内Na⁺/K⁺比率来抵御盐胁迫，然而，这一过程是怎么实现的我们知之甚少。

2007年，澳大利亚的科学家采用“非损伤微测”等技术研究了盐胁迫下大麦的K⁺流和Na⁺流，揭开了Na⁺/K⁺平衡实现的过程。耐盐基因型大麦实现抗盐这一过程是多种机制综合作用的结果，这些机制包括：（1）通过控制膜电压来保持更高的负电势；（2）提高H⁺泵的活性；（3）提高细胞的排Na⁺能力；（4）增加对Ca²⁺的敏感性。同时，对照品种的单向²²Na⁺流入或者去极化激活后的外流K⁺通道的密度和电压依赖性不存在显著差异。研究结果和K⁺/Na⁺是植物耐盐性的决定因素相一致，说明植物的耐盐是由多种途径控制。这个研究结果为品种筛选提供了一种有效的方法。

将非损伤微测技术应用于离子转运机制的研究中，检测离子的动态平衡和其他信息，已经被科研人员广泛接受并实际应用，取得了突破性的进展。

关键词：盐胁迫(salt-stress); 大麦(barley); 非损伤离子选择性微电极技术(MIFE); K⁺ flux; Na⁺ flux.

参考文献：Zhonghua Chen, et al, Plant Physiology, 2007,145, 1714-1725

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第19期--Ca2+外流作为细胞防御过程中的标志性反应

Ca²⁺外流作为烟草对假单胞菌超敏反应的指标

图注：使用非损伤微测技术检测到烟草叶肉细胞经P.syringaepv syringae 61处理后Ca²⁺流以及在光暗交替处理后、在缓冲液中平衡不同时间后Ca²⁺流的变化情况。正值为内流。

跨膜离子流在启动和调控防御机制中起着重要的作用。植物在受到外界环境刺激以后，离子通道迅速做出调整，在识别病原体反应中离子流是其中较早发生的事件之一。Lev G. Nemchinov等科学家推断在植物的病原超敏反应中，质膜Ca²⁺-ATP泵是超敏反应的关键。

美国农业部（USDA）的科学家采用“非损伤微测技术（MIFE）”检测了经丁香假单胞菌处理之后Ca²⁺流的变化情况，发现Ca²⁺内外流与细菌处理的时期有关，经细菌长时间处理后烟草叶片出现Ca²⁺外流。Ca²⁺通道阻断剂钆和镧都可以显著地将黑暗条件下的Ca²⁺流转变为外流，铯则明显削弱了光诱导的Ca²⁺流，但并不产生Ca²⁺外流。与之相反的是，Ca²⁺-ATPase的抑制剂CPA无论是在光照条件下还是黑暗条件下都能够增强Ca²⁺吸收。

Ca²⁺不仅在激活防御反应中作为第二信使起作用，而且可能在后期的加速细胞死亡、抑制病原体侵染扩散以及结束防御反应中作为下游调控者。本研究通过Ca²⁺流的转变认识到了细胞防御反应中的关键成分，建立了细胞死亡与防御过程中的离子流模型。

关键词：钙离子外流(Ca²⁺ efflux); 超敏反应(Hypersensitive response); 非损伤微测技（MIFE）

参考文献：Lev G. Nemchinov, et al. Plant Cell Physiol. 2008, 49: 40-46

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第18期--PKS5负调控质膜质子泵

蛋白激酶PKS5通过阻断质膜H⁺-ATP酶与14-3-3蛋白的相互作用抑制其活性

图注：使用非损伤微测技术检测到的拟南芥野生型和pks5根部尖端和成熟根部质子流。正值为外流。

如何调控细胞的pH梯度对植物响应激素和环境非常重要，例如生长素、蓝光和真菌的分泌物。然而，这个调控过程中的信号是什么依然知之甚少。丹麦Copenhagen 大学的Fuglsang和中国科学家郭岩等报道了PKS5（一种拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）是质膜质子泵（PM H⁺-ATPase）的负调控因子。

Fuglsang和郭岩等科学家采用“非损伤微测技术（MIFE）”检测了不同pH条件下拟南芥pks5突变体根中净质子流量的变化情况，发现在根部成熟区测得的H⁺流野生型和突变体没有明显差异，而在根尖处，野生型内的H⁺外流远远高于突变体，pks5突变体植株把质子排出胞外因而能够忍耐外部更高的pH。PKS5在C端调控区域的Ser931位点磷酸化PM H⁺-ATPase AHA2，磷酸化抑制PM H⁺-ATPase和有活性的14-3-3蛋白的相互作用。PKS5与Ca²⁺结合蛋白SCaBP1相互作用，引起胞外高pH促进胞内Ca²⁺的增加。

PKS5是新的Ca²⁺信号途径的调控者，控制PM H⁺-ATPase的活性和胞外的酸化。这一发现支持了在pks5-1中PM H⁺-ATPase的活性较高这一观点，这也为翻译后修饰控制离子通过质膜的运输提供了一个新的实例。

关键词：PKS5；质膜质子泵（PM H⁺-ATPase）；非损伤微测技术(MIFE)

参考文献：Anja T.Fuglsang, et al. The Plant Cell, 2007, 19:1617-1634

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旭月NMT简报---关键词搜索：

用离子流技术和荧光蛋白提高胞内外Ca2+和H+的时空分辨率

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