使用非损伤微测技术进行虹鳟鱼卵母细胞Rh糖蛋白功能的研究

图注：用非损伤微测技术测定H2O2,Rhag-,Rhcg2-和Rh30-like注射进卵母细胞后对NH4+的吸收以及NH4+吸收的动力学。

胺跨膜的转运是维持生物体氮代谢和氮平衡的关键因素。虹鳟鱼腮的胺转运可能通过Rh糖蛋白调节。

2010年，加拿大的科学家使用非损伤微测技术研究了虹鳟鱼不同的Rh糖蛋白（R Rhag, Rhbg1, Rhbg2, Rhcg1, Rhcg2, Rh30-like）在卵母细胞中表达后的胺转运。除Rh30-like外，其他的Rh蛋白都能够促进甲胺的吸收，吸收可达到饱和，Km值在 4.6-8.9mM。胞外的pH值从7.5升高到8.5，导致甲胺的最大流速（Jmax）增加了3-4倍。当糖蛋白全部表达或者质子化甲胺时Km值没有变化。pH梯度刺激甲胺外流和内流的比率和H⁺梯度的增加成正相关。

本研究使用非损伤微测技术证实了Rhag和Rhcg2促进胺的吸收，但是Rh30-like蛋白不能促进吸收。在低底物浓度下，胺的吸收速率比甲胺高。胺的Km值在虹鳟鱼的生理范围之内。

这项研究发现虹鳟鱼腮的Rh糖蛋白具有低亲和力，以及高的胺转运能力形成的pH梯度，当胞浆胺浓度升高的时候，促进了胺的快速外流。这项研究为我们认识胺的转运提供了直接的证据，非损伤微测技术能够直接测定活体的NH₄⁺以及NO₃^-的流速，对于研究氮的转运，研究蛋白的功能有很大的意义。

关键词：胺转运，Rh糖蛋白，卵母细胞，虹鳟鱼，非损伤微测技术

参考文献：Nawata CM, et al. Journal of Experimental Biology, 2010: 213, 1049-1059.

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根部离子流速与铝毒耐性相关

图注：酸性胁迫及酸性/铝毒联合胁迫对拟南芥根部伸长区(上图)及成熟区(下图)H+流速的影响。（正值代表内流，负值代表外排）

酸性土壤中，铝（Al）影响植物根部的生长，而酸性（低pH）也影响植物根部的生长，且根部铝毒害与酸性（低pH）毒害的表现一致。这样就给研究人员提出一个问题：植物的耐铝毒与耐酸性之间是否受同一种机制控制？

为了阐明这一问题，澳大利亚研究人员选取四种基因型的拟南芥（野生型、耐铝毒的突变体alr104，铝毒敏感突变体als3和als5）作为研究材料，进行酸性胁迫及酸性/铝毒联合胁迫后，通过非损伤微测技术测定根部H⁺及K⁺流速，同时还测定了根部周围碱化能力、内部钾离子浓度、质膜电势变化（Em）等数据指标。

结果表明，als5和alr104突变体都耐酸性胁迫，alr104还耐酸性/铝毒的联合胁迫，als5及als3的铝毒敏感型基本一致。铝诱导引起的铝毒敏感型突变体（als3及als5）根部伸长区H⁺内流及成熟区H⁺外流强度均比野生型及alr104的强。根部伸长区膜电位（Em）的变化趋势与K⁺流的变化相符：alr104及野生型拟南芥根部伸长区K⁺外流比铝毒敏感型的强。

最后研究人员得到以下结论，alr104的铝毒耐性与膜电位去极化、强K⁺外流、强H⁺内流有关，强H⁺内流导致根系周围土壤碱化，从而缓解酸性及铝毒的联合胁迫作用；als5的耐酸性主要与H⁺的高效吸收有关，而这种吸收可被Al胁迫所终止。以上研究结果为铝毒危害机理提供了有力的实验证据，也为制定土壤铝毒害防治方案奠定了理论基础。

关键词：铝毒害(Aluminium toxicity)，H⁺流(H⁺ flux)，K⁺流(K⁺ flux),质膜电势(plasma membrane potential)

参考文献：J. Bose et al. J. Exp. Bot, 2010, 61(11):3163-3175

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与厌氧土壤相关的次生代谢物对大麦根部离子流及电生理的影响

图注：采用非损伤微测技术测定了不同代谢产物对两种基因型大麦NN和TX的K+、H+、Ca2+流的影响。

淹水的主要危害之一是造成土壤缺氧，导致厌氧微生物大量积累有毒物质。了解淹涝对植物生长影响的机理，揭示其适应机制，从而合理选择和定向培养耐涝品种，减轻淹涝对农业生产的危害有重要的意义。目前的研究集中在改善耐涝植物对氧气保持和运输方面，而植物对次生代谢物的抗性研究还没有一个可靠的研究方法。

澳大利亚的科学家Shabala使用非损伤微测技术（MIFE）检测两种不同基因型的大麦NN和TX根部次生代谢产物对细胞膜离子转运过程的影响。水淹敏感的的品种“Naso Nijo”被三种一元羧酸（甲酸、乙酸、丙酸）和三种石碳酸（苯甲酸、2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸）处理都能引起稳定的K⁺外流，并伴随着H⁺内流，但是在耐涝品种TX的根细胞中没有K⁺的显著改变。石碳酸处理增加了Ca²⁺内流，另一些代谢物引起了Ca²⁺的外流。长期处理（24h）后所有的代谢物引起了的K⁺吸收的显著减少。一元羧酸处理24h后H⁺由外流转变成内流，三种石碳酸对H⁺没有显著影响。基于药理学实验和膜电势的结果，提出了一个解释次级代谢物对膜转运活性影响的模型。这项研究发现植物对次级代谢物的忍耐在育种当中是一个非常有用的特征。

大麦抗涝基因不仅赋予根解剖差异，而且可在很大的程度上减少次生代谢产物对膜在运输过程中的不利影响，特别是改善K⁺的保留情况。这方面的研究将给以后的研究和育种提供新的方法。

关键词：非损伤微测技术（MIFE）、大麦（barley）、次生代谢物（secondary Metabolite）、厌氧菌（anaerobic）、离子流（Ion flux）

参考文献：Jiayin Pang, et al. Plant Physiology, 2007, 145: 266-276

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胞外的Ca²⁺内流参与罂粟的自交不亲和性反应

图注：采用非损伤微测技术测定Ca2+ flux。 上图：花粉管不同部位的Ca2+ flux测定和矢量图； 下图：加入S蛋白后花粉管的Ca 2+振荡和Ca2+内流被抑制。

自交不亲和性（Self-Incompatibility, SI）是指某一植物的雌雄两性机能正常，但不能进行自花受精或同一品系内异株花粉受精的现象。自交不亲和性是广泛存在于显花植物中的一种种内生殖障碍，对于物种避免近亲交配和保持遗传多样性具有重要意义。在过去的十多年中，科学家发现不亲和的罂粟花粉中胞内自由Ca²⁺的增加可以激发自交不亲和性反应。然而，胞外的Ca²⁺是否参与这个过程，一直没有得到证实。

近来，研究人员使用非损伤微测技术测定了罂粟花粉管的Ca²⁺流说明了这一问题。研究发现Ca²⁺内流和振荡在花粉管生长中出现，自交不亲和性蛋白（S蛋白：14kD）能够刺激Ca²⁺内流，这个内流的部位在花粉管尖端后的50mm处。这些SI诱导的Ca²⁺内流说明了在SI反应中胞内Ca²⁺的增加是由于胞外的Ca²⁺进入细胞而引起。同时发现，Ca²⁺通道抑制剂Gd³⁺和La³⁺抑制花粉管正常的Ca²⁺内流和振荡，抑制花粉管生长。

非损伤微测技术对于研究自交不亲和性有无可比拟的优势，活体、动态地检测细胞的振荡信号，并且可以得到真实、稳定的Ca²⁺信号。

关键词：自交不亲和性（self-incompatibility）；罂粟（Papaver rhoeas）；Ca²⁺信号（Ca²⁺ signaling）

参考文献：Franklin-Tong VE, et al. Plant Journal, 2002, 29: 333-345

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