Proceedings of Non-invasive Micro-test Technology (NMT)

in China

(Issue No. 2, 2012)

 

非损伤微测技术论文集

 (第二册)

 

 

 

 

旭月（北京）科技有限公司

2012年4月

北京

序

 

        据2012年3月2日《华盛顿邮报》报道，美国副总统拜登在爱荷华州立大学（Iowa State University）演讲时说：“中国为什么没有成为世界上最有创新力的国家之一？为什么他们要窃取我们的知识产权？为什么外国公司要拱手让出商业秘密后才被允许进入有13亿人口的中国市场? 因为他们（中国）没有创新能力。” （见链接）

        我们在此不对拜登先生的污蔑言辞进行全面反驳，但如果拜登先生看到旭月公司出版的非损伤微测技术（NMT）论文集，特别是现在的第二册论文集面世时，他肯定要对自己说的不符合实际的话感到羞愧。因为当前中国在NMT领域已经处于世界领先水平，无论在NMT技术本身还是NMT的应用，已经把美国科研同行抛在了后面。

        近年来，越来越多的中国科研人员以NMT为创新平台，纷纷抢占自身领域的科研制高点，迅速登上了世界学术的高峰。例如，在这期论文集中，北京林业大学的陈少良实验室首次发现和证实了胞外的ATP可以诱导胡杨细胞的PCD过程以及它的信号转导途径；河北师范大学的尚忠林实验室首次测定到了单个保卫细胞（活细胞）的Ca²⁺和H⁺流速，为解释G蛋白和ROS调节气孔的开闭提供了证据等一系列成果。

        虽然在美国和世界上不少国家的科研人员也以NMT为平台正在进行大量工作，但与中国科研人员使用NMT的状况相比，就有些相形见绌。仅就2011年发表的文章数量而言，中国科研人员应用NMT发表的成果已经相当于国外同行所发表的成果总和。

        2012年，中国科研人员以NMT为平台开展的科研项目如雨后春笋般地涌现，而且将更加具有自主创新性。在这种令人鼓舞的发展趋势下，人们定能看到更多的高水平的创新成果出现。那种质疑中华民族创新能力的言论定会被事实所荡涤无存。

        面对这样的大好趋势，您准备好了吗？

 

                                                                                                                   许  越

                                                                                                       2012年4月于北京

前言

        回顾6年前，非损伤微测技术在国内刚刚起步，那时候大家对非损伤微测技术知之甚少。

        5年后的2011年，非损伤微测技术从一个陌生的名词成为了大家期望使用的技术，并且诞生了一大批使用非损伤微测技术的研究成果。因此，我们在2011年发布了《非损伤微测技术论文集》第一册，总结了5年来中国科学家的优秀成果。

        回顾过去，我们惊喜地发现，非损伤微测技术在国内应用的速度更快。仅在2011年一年，使用非损伤微测技术发表的优秀SCI论文超过了14篇，累计影响因子超过了48。这样的成果，让我们备受鼓舞。因此，在这春暖花开的季节里，我们制作了第二册非损伤微测技术论文集，以助大家更好地了解和使用非损伤微测技术。

        2011年的使用非损伤微测技术的研究成果体现在多个领域中，无论是在胡杨细胞中发现的胞外eATP的信号转导途径，还是植物在盐胁迫中的特殊机制，都给我们的研究带来了全新的认识。另外，也研究了植物响应重金属Cd²⁺的毒害机制，发现了大豆需要通过分泌H⁺来维持自身的固氮能力，以及发现了一种基因通过调节植物在低钾条件下更好地吸收K⁺来耐受低钾环境，重要的是，非损伤微测技术的研究更加微观，例如直接测定了单个保卫细胞的Ca²⁺和H⁺流速，也实时测定了单个液泡的H⁺流速，这为我们在单细胞和细胞器水平的研究提供了依据。相比植物领域的研究，医学领域也出现了重要的成果，例如发现药物通过影响Cl^-的分泌从而发挥自身的药效。

        在国际上，葡萄牙的JoséA Feijó实验室在Science封面发表了GLR作为Ca²⁺通道的研究成果，真正揭开了非损伤微测技术在现代分子生物学中的应用，发现了受体可以做为新的离子通道。除离子的研究之外，分子O₂流速的研究也揭示了基因的功能，为细胞代谢效率的研究提供了新的思路，耶鲁大学的Elizabeth A. Jonas实验室在Nature Cell Biology发表文章，发现神经元的代谢效率与O₂的流速有直接关系，这种O₂流速的变化受细胞凋亡因子的调节。

        无论是国内或是国际上，非损伤微测技术的应用已经日趋广泛，解决的问题也越来越多，集中体现在研究的精细性和深入性，把我们的研究引向活体水平的同时，无论是在细胞器、单细胞还是组织层次，都给予了便捷的测量。

        第二册非损伤微测技术论文集的发布，进一步见证了我国非损伤微测技术为科研提供的优秀工具，期望通过我们的共同努力推动我国的科研发展。

 

一．ATP信号转导途径：胞外ATP（eATP）触发胡杨的程序性细胞死亡

ATP不仅是活细胞的能量来源，也是植物细胞信号转导途径中的重要物质。大量的证据表明胞外的ATP（eATP）调节植物的膜电势、气孔开度、棉花纤维的伸长、根毛和花粉管的生长、生长素的转运、基因表达和细胞活性。eATP也调节高等植物细胞活性和病原防御反应。但是，ATP的信号转导过程和参与的植物程序性细胞死亡（PCD）的分子网络还没有阐明。

北京林业大学陈少良实验室使用非损伤微测技术、激光共聚焦显微镜等方法研究了eATP诱导的PCD信号转导途径，发现eATP激活胡杨的程序性细胞死亡，导致出现细胞质皱缩、染色质聚集和DNA片段化。同时胞质中Ca²⁺升高，H₂O₂积累，线粒体跨膜电势增加，细胞色素c释放。而且，eATP诱导胞内ATP增加，这对半胱氨酸水解酶和随后的PCD必不可少，与线粒体跨膜电势的增加有关。因此，根据研究结果推测ATP是通过结合质膜上的嘌呤受体，引起下游中间信号反应，这种PCD信号被动物P2受体拮抗剂suramin所终止。

这项研究阐述了胡杨PCD中的ATP信号途径，建立了eATP诱导PCD的模型，为进一步认识ATP的信号网络提供了必不可少的证据。此研究和活体测定方法也为其他类似的研究提供了思路，例如胞外H₂O₂、谷氨酸（Glu）等新的信号途径的研究。

 

图注：胞外ATP引起了Ca²⁺的内流和胞内Ca²⁺的升高。

Sun J,et al. An ATP signalling pathway in plant cells: extracellular ATP triggers programmed cell death in Populus euphratica, Plant, Cell & Environment, 2012, 35(5):893-916.(2010 IF 5.145)在线阅读请点击

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二．凯氏带阻隔Na⁺的流动

凯氏带（Casparian bands）是由木栓化物质沉积在内皮层细胞初生的径向壁和横向壁上形成的，是细胞壁的组成部分，并不仅仅是化学物质在细胞壁表面的沉积，并在阻隔质外体离子移动和水通过植物皮层进入根的中柱的过程中具有重要作用。

为了证实凯氏带具有阻隔离子吸收的作用，中国科学院植物研究所林金星实验室研究了水稻根部结构的差异，使用非损伤微测技术测定了Na⁺流速，说明Na⁺流动在不同发育的水稻根中有显著的位置差异，幼小的侧根原基部位Na⁺的也有显著吸收。侧根原基（区域III）打断了外皮层和内皮层的凯氏带，这个部位的Na⁺吸收显著高于根尖区域。另外，凯氏带未形成区域（区域I）的Na⁺吸收大于凯氏带形成的区域（区域II）。水稻根部不同区域的Na⁺流动的差异可能是由于凯氏带的阻隔和质外体的渗透势引起，由于侧根原基的发育，在根上打开了一个Na⁺流动的窗口，导致区域III具有最大的Na⁺吸收。

凯氏带对土壤中的离子进入维管柱有选择作用，还能防止维管柱内的无机成分和营养物质向外扩散，特别是在干旱环境下，凯氏带有效地保护了内皮层以内的组织。对于植物离子的吸收和营养、水分的保持具有重要作用。这项工作证实了凯氏带可以影响Na⁺的流动，为凯氏带影响离子吸收的作用提供了直接的证据。

图注：使用非损伤微测技术测定了水稻根部不同区域的Na⁺流速，发现不同区域Na⁺吸收有显著差异。

Zhou QY, et al. Net sodium fluxes change significantly at anatomically distinct root zones of rice (Oryza sativa L.) seedlings.Journal of Plant Physiology, 2011, 168(11):1249-1255. (2010 IF 2.5)

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三．Cd²⁺影响细胞壁的构建

Cd²⁺是一种有毒的重金属离子，抑制植物的许多生理过程。如何认识Cd²⁺对细胞壁影响的机制，则是我们研究Cd²⁺毒性的一个重要方向。

中国科学院植物研究所林金星实验室使用非损伤微测技术测定了拟南芥根毛在CdCl₂处理下的Ca²⁺流速，研究了拟南芥根毛发育期间细胞壁和尖端生长对CdCl₂处理的响应。发现CdCl₂处理抑制种子的萌发和根的伸长，这个过程具有剂量和时间依赖性。CdCl₂抑制胞外Ca²⁺的内流，促进胞内Ca²⁺的外流，打乱胞质尖端聚集的Ca²⁺梯度，即在正常情况下拟南芥根毛尖端的Ca²⁺内流，在20µm CdCl₂处理后Ca²⁺的内流被抑制，40µm的CdCl₂处理后Ca²⁺外流。结果表明CdCl₂诱导Ca²⁺梯度和肌动蛋白丝的紊乱，影响拟南芥根毛细胞壁的组成和囊泡运输。

这项工作通过研究Cd²⁺对细胞极性和Ca²⁺流速的影响，揭示了Ca²⁺外流破坏了Ca²⁺梯度，进而改变囊泡运输，导致细胞壁解聚，尖端生长受到破坏。研究为CdCl₂影响拟南芥的细胞生物学机制提供了证据。

图注：正常情况下拟南芥根毛的Ca²⁺内流，在20µm CdCl₂处理后Ca²⁺的内流被抑制，40µm的CdCl₂处理后Ca²⁺外流。

Fan JL, et al. Disarrangement of actin filaments and Ca²⁺ gradient by CdCl₂ alters cell wall construction in Arabidopsis thaliana root hairs by inhibiting vesicular trafficking. Journal of Plant Physiology, 2011, 168(11): 1157-1167. (2010 IF 2.5)

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四．NaCl胁迫下大豆Cl^-毒害的机理研究

盐胁迫是农业生产中遇到的严重问题，如何选取耐盐性的农作物，是我们解决盐危害的重要手段之一。大豆是一种对盐比较敏感的作物，为了研究盐忍耐的大豆，比较了不同品种间的大豆对NaCl的响应情况。

南京农业大学於丙军实验室选取了盐敏感的大豆品种N23674，盐生大豆品种BB52，以及它们的杂交株系4076。实验结果发现NaCl胁迫影响种子的萌发，导致组织损伤。用140mMNaCl处理1h、4h、8h、12h、2天和4天后，发现Cl^-的含量在三个品种的根和叶中持续增加，根中Cl^-含量在三个品种间的顺序是BB52>4076>N23674，而在叶片中相反。使用非损伤微测技术测定了根和叶片，以及从他们中分离出的原生质体的Na⁺和Cl^-流速，在140mMNaCl中胁迫2、4和6天后，发现三个品种的Cl^-内流差异很大，尤其在原生质体中。这个结果说明了NaCl胁迫过程中Cl^-是主要的限制因素，盐忍耐主要是由于植物的地上部分如叶片对Cl^-的限制能力。

这项工作比较了不同盐忍耐的大豆品种在NaCl诱导下离子流的转换情况和生理机制，为盐忍耐大豆的种质创新提供了理论基础。

图注：NaCl处理不同时间后3个品种加大豆的原生质体的Na⁺和Cl^-流速的变化。

Zhang XK, et al. Differential Cl^-/salt tolerance and NaCl-induced alternations of tissue and cellular ion fluxes in Glycine max, Glycine soja and their hybrid seedlings.Journal of Agronomy and Crop Science, 2011, 197(5): 329-339.  (2010IF 1.952)

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五．真菌相互作用促进质子（H⁺）释放

大多数豆科植物与真菌共生。丛枝菌根真菌（AM）对磷（P）的吸收和根瘤菌对氮（N₂）的固定具有重要的农学和生态学意义。植物-AM真菌-根瘤菌三个共生如何高效吸收营养的机制受到很多关注。AM真菌和根瘤菌能够有效地增加固氮和植物对土壤中磷的吸收，但这破坏了根部阴阳离子平衡，过多的阳离子需要从根部分泌出来才能达到平衡，H⁺是分泌的最主要阳离子。然而，无论根瘤能够直接释放H⁺引起土壤的酸化，以及AM真菌是怎么影响真菌菌根的这个过程还是不清楚。

中国农业大学冯固实验室把丛枝菌根真菌（GM）和慢生大豆根瘤菌（BJ）注射到大豆苗中，通过非损伤微测技术研究了两种真菌单独的作用和相互作用对根瘤或者根外菌丝的H⁺外流。GM把真菌菌根侧根根瘤的H⁺外流提高了3倍，BJ把侧根接近根瘤部位菌丝的H⁺外流提高了8倍。植物P含量的增加与根瘤和菌丝的H⁺外流呈显著的线性正相关。研究结果认为侧根AM真菌诱导了固氮酶的活性，增加了根瘤的H⁺外流。

这项研究使我们认识到真菌菌根和根瘤菌相互作用增加了根瘤空间和菌丝空间酸化的程度，对进一步研究植物固氮和P的作用提供了依据。

 

 

图注：非损伤微测技术测定大豆根部根瘤和菌丝的示意图以及P含量与H⁺外流呈显著的线性正相关。

Ding XD, et al. Synergistic interactions between Glomus mosseae and Bradyrhizobium japonicum in enhancing proton release from nodules and hyphae. Mycorrhiza, 2011, 22(1): 51-58.  (2010 IF 2.571)

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六．RNA解旋酶调节低K⁺忍耐

土壤的营养对植物的生长和代谢过程非常重要，植物需要从土壤中获取营养，并且演化出在不同的营养条件下确保能够继续吸收营养的适应机制。K⁺是重要的营养物质，在低K⁺胁迫下，很多植物表现出了不同程度的症状，如叶片发黄、生长受抑制等。过去的研究发现AKT1、HKT、KT⁄KUP⁄HAK家族的基因在K⁺转运中起到重要作用，但是关于细胞如何感受不同浓度的K⁺知道的不多。

山东农业大学郑成超实验室发现了一种分子马达蛋白——拟南芥的DExD⁄H框RNA解旋酶基因AtHELPS的表达受到低K⁺、玉米素和冷处理的诱导，高K⁺胁迫导致表达下调。在低K⁺条件下AtHELPS影响了拟南芥种子的萌发和重量。在低K⁺胁迫下helps突变体中AKT1、CBL1⁄ 9 和CIPK23 mRNA的水平比超表达的高。用非损伤微测技术（NMT）直接测定了K⁺流速，发现低K⁺胁迫下helps突变体的K⁺内流显著增加，但是AtHELPS超表达的材料K⁺流速很低。这些结果提供了植物DExD⁄H框RNA解旋酶的功能分析的信息，发现了植物忍耐低K⁺胁迫的负调控因子。

非损伤微测技术已经成为研究生理功能的有效工具，在这个研究中，科学家应用NMT直接测了拟南芥根部K⁺流速在不同基因型直接的差异图谱，为解释基因的功能提供了直接的证据。

图注：低K⁺胁迫影响拟南芥根部分生区K⁺流速的图谱。

Xu RR, et al. A DExD⁄H box RNA helicase is important for K⁺ deprivation responses and tolerance in Arabidopsis thaliana. FEBS Journal, 2011, 278: 2296-2306.(2010 IF 2.571)

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七．灰杨在Cd²⁺胁迫下的Cd²⁺流速和Cd²⁺积累

镉（Cd）是广泛使用的重金属，植物吸收了环境中的Cd²⁺进而对人类健康造成了危害，因此，减少环境中的Cd²⁺是一项重要的工作。杨树是非常好的植物修复物种，因此研究杨树对Cd²⁺的富集具有重要意义。

西北农林科技大学的罗志斌实验室研究了灰杨根、木质部、韧皮部和叶片的能量代谢、活性氧以及抗氧化能力。把灰杨小苗暴露在含有0和50µmCdSO₄的营养液中处理了24h和20天，用非损伤微测技术测定了根际的Cd²⁺流速和内部的Cd含量。Cd²⁺处理24h后，根尖出现了强烈的Cd²⁺内流，在根尖之后Cd²⁺内流缓慢下降。大量的Cd²⁺在根部积累后，Cd²⁺通过木质部装载到叶片，然后运输到韧皮部。Cd²⁺积累导致光合作用碳同化能力下降，但是没有消耗可溶性糖。研究结果表明灰杨内部的Cd²⁺分配是一个复杂的模式，在不同组织中不同，可能是因为这些组织产生的可溶性酚树脂的能力有差异。

灰杨根部的Cd²⁺内流体现出了明显的空间和时间动力学模式，酚树脂在清除Cd²⁺诱导的ROS中扮演着重要作用，这为筛选Cd²⁺忍耐的杨树品种和产生大量酚树脂的杨树品种提供了有价值的数据。

 

图注：灰杨根部不同区域的Cd²⁺流速变化趋势图以及根尖的Cd²⁺吸收速率。

He JL, et al. Net cadmium flux and accumulation reveal tissue-specific oxidative stress and detoxification in Populus × canescens.Physiologia Plantarum, 2011, 143(1): 50–63. (2010 IF 3.067)

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八．小麦基因TaST能够增加转基因拟南芥的盐忍耐

在盐环境中作物生长受到抑制，最终影响作物的产量。在小麦中发现了一个基因TaST在盐胁迫后表达增加，为了确定这个基因的功能，把它转入拟南芥中，研究是否能够增加拟南芥的抗盐能力。

河北师范大学的黄占景实验室使用非损伤微测技术等方法测定了Na⁺流速和渗透物质的含量，研究发现小麦的基因TaST的表达受到盐胁迫的诱导，把TaST基因转入拟南芥中超表达，转基因材料比Col表现出了更明显的盐忍耐能力，亚细胞定位研究揭示这个基因编码的蛋白质在细胞核内，和Col相比，转基因的拟南芥在盐胁迫后积累更多的Ca²⁺、可溶性糖、脯氨酸和更低的Na⁺。所有的数据说明TaST能够增加转基因拟南芥的盐忍耐能力。

本文利用非损伤微测技术研究了小麦TaST基因转入拟南芥体内后对拟南芥耐盐性的影响，发现TaST基因过表达的拟南芥幼苗根部在盐处理后Na⁺呈现明显的外流（而作为对照的野生型拟南芥则呈现较多的Na⁺内流）。这直接证实了TaST基因能增强植物的排盐能力进而达到抗盐的目的。

图注：转基因拟南芥TaST比Col具有显著的Na⁺外排能力，TaST材料Na⁺明显外流，Col材料Na⁺小内流。

 

Huang X, et al. The wheat gene TaST can increase the salt tolerance of transgenic Arabidopsis.Plant Cell Reports, 2012, 31(2): 339-347.（2010 IF 2.279）

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九．实时测定液泡的离子进出

液泡膜H⁺运输的传统测定方法是通过pH荧光染料进行体外检测完成的。然而，该方法中高纯度的液泡膜分离复杂，且对微弱的H⁺实时监测的灵敏度不够，成为影响研究人员使用的原因。近年来，非损伤微测技术（NMT）已经广泛地应用于离子运输的研究中。虽然通过NMT已经测定了甜菜液泡的Ca²⁺流速，但还没有对液泡H⁺流速的测定报道。因此，建立液泡以及细胞膜系统H⁺流速测定的方法，对研究质子的运动和膜蛋白活性具有重要意义。

中国科学院植物研究所李银心实验室对NMT测定液泡的H⁺流速进行了方法上的修正，使NMT可以更准确地对液泡H⁺流进行测定。研究首先根据NMT的可视化测定的特性，简化了液泡提取方法，省略了传统检测中繁琐的超速离心的步骤。在200mMNaCl胁迫下，H⁺外流增加，但是TS15的H⁺外流要显著强于WT的外流，说明在转基因植株中NHX1具有更高的活性。在200mMNaCl条件下施加ATP和PPi，液泡△H⁺流速的变化反映H⁺-ATPase和PPase的活性大小。在施加ATP后，转基因烟草液泡表现出更大的△H⁺流速，该结果说明转基因植株比WT植株在NaCl条件具有更高的V-ATPase活性。同时，测定H⁺-ATPase和PPase酶活结果也证实了两者的一致性。与传统方法相比，NMT从操作、结果精度和信息量上都具有更大优势。

本研究建立和修正了一种合适的液泡H⁺流速的测定方法。用离子流差异还可以反映更多的生理特征，是一种可以替代传统V-ATPase和PPase的活性测定方法的新手段。这种简单的方法将来能够广泛地进行亚细胞和细胞器水平离子流速的检测和分析。

图注：在正常和200mMNaCl盐激下SeNHX1转基因和WT烟草液泡的H⁺净流速。

Chen XY, et al. Modified noninvasive microtest electrophysiological technology for vacuolar H+flux detection.Analytical Biochemistry, 2011, 418: 295–297. (2010 IF 3.236)

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十．胞外ATP通过异源G蛋白α亚基和ROS促进拟南芥气孔的开放

三磷酸腺苷（ATP）是胞内最重要的能量分子，也是植物细胞重要的信号分子。近年来发现ATP也在胞外空间存在，胞外的ATP（eATP）在植物生长、发育和胁迫忍耐中起到重要作用。因此胞外ATP的作用备受大家关注。

河北师范大学尚忠林实验研究了eATP对拟南芥气孔开闭的调控作用，发现eATP对G蛋白、活性氧（ROS）、胞质Ca²⁺及质膜H⁺-ATP酶等重要分子和离子都有影响，但是AMP和ADP对气孔的运动没有影响。ATP促进的气孔开放的过程被NADPH氧化酶抑制剂所阻止，或者被脱氧剂DTT所抑制。非损伤微测技术发现ATP可以诱导保卫细胞Ca²⁺的内流及H⁺的外流，为阐明ATP的作用机制提供了直接的证据。研究结果说明eATP促进气孔的开放可能涉及到异源的G蛋白、ROS、胞质Ca²⁺和质膜H⁺-ATPase。

本文利用非损伤微测技术、激光共聚焦成像技术等先进研究手段，从多方面研究了eATP对气孔的影响机理，为ATP通过ROS等调节离子的流动提供了研究范例，尤其是直接研究单个保卫细胞的离子流速。

图注：胞外ATP引起了拟南芥野生型材料保卫细胞的Ca²⁺内流和H⁺外流，而突变体没有变化。（此图中的正值表是内流，负值表示外流）

HaoLH, et al.Extracellular ATP promotes stomatal opening of Arabidopsis thaliana through heterotrimeric G protein a subunit and reactive oxygen species. Molecular Plant, 2011, doi: 10.1093/mp/ssr095. （2010 IF 4.296）

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十一．盐处理棉花不同根区影响水分利用、Na⁺再循环和Na⁺、H⁺的流速

植物响应盐胁迫依赖于土壤中的环境因子，其中一个因子是根际盐分的不均一分布，这导致植物对盐分响应的不同。

山东省农业科学院董合忠实验室建立了棉花的分根系统（Split-root system），研究了棉花对不均一盐胁迫的响应。使用非损伤微测技术测量了棉花根部盐胁迫条件下的Na⁺和H⁺的流速，发现与均一盐胁迫相比，不均一盐胁迫条件下如果一侧分根被高盐处理，则另一侧低盐处理，则分根的Na⁺外流速度会明显增大，该过程与质膜Na⁺/H⁺反向转运体相关。在非均一盐胁迫下这种分根系统促进植物的生长主要是由于增加了棉花的水分利用、减少了叶片Na⁺的浓度，以及把过量的Na⁺转运到低盐的一边，并且促进了低盐中根的Na⁺外排。

Na⁺/H⁺反向转运体在植物盐胁迫过程中的作用是热门的研究课题，本文以非常新颖的不均一盐胁迫为切入点，深入研究了棉花对这种盐胁迫响应的机制，通过提高离子转运和水分利用进而提高棉花应对盐胁迫的伤害，这个过程受到Na⁺/H⁺反向转运体的调节。

 

 

图注：矾酸钠（sodium orthovanadate，500 µM) 和阿米洛利（amiloride，100 µM) 对不同浓度NaCl处理下棉花根部Na⁺和H⁺流速的影响。

 

Kong XQ,et al. Effects of non-uniform root zone salinity on water use Na⁺ recirculation, and Na⁺ and H⁺ flux in cotton.Journal of Experimental Botany, (2011) doi: 10.1093/jxb/err420（2010 IF 4.818）

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十二．水稻根际存在一种新的生物阴极微生物燃料电池

湿生植物拥有独有的在根际释放氧气和有机物质的能力。已经知道微生物染料电池（MFCs）能够利用来自植物的有机物质作为重要的电子供体，但是对MFCs根部的泌氧还不知道。

中国科学院生态环境研究中心朱永官实验室以水稻为研究材料，利用非损伤微测技术技术和微生物燃料电池技术研究了在瞬时和长期尺度下，水稻向根际向环境中释放氧气（O₂）的能力。实验发现在水稻根际存在一个新型的生物阴极，并且它能够传递电子到根的泌氧过程中进行氧化还原反应。根际的电压随着根的生长缓慢增加，但是大约在1个月后电压消失。实验结果说明从水稻根部氧气的外流速率依赖于根的成熟时期。

这项研究为将来发展一个新的MFCs和评价湿生植物生态功能中氧气的变化提供了帮助，也可以从湿生植物根部构建高效的生物阴极。本文是典型的交叉学科研究，选题独特，结果清晰，创新性强，使用非损伤微测技术直接测定了根际的氧气流速，可供环境科学、生命科学及其它相关领域的研究人员参考。

图注：水稻根部不同区域在缺氧条件下氧气流速的变化。正值代表内流，负值代表外流。

Chen Z, et al.A novel sediment microbial fuel cell with a biocathode in the rice rhizosphere. Bioresource Technology, 2012, 108: 55-59.（2010 IF 4.365）

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十三．恩他卡朋促进大鼠cAMP依赖的Cl^-分泌

恩他卡朋（Entacapone）是一种广泛用于帕金森疾病（PD）治疗的药物，是儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）的抑制剂。然而，恩他卡朋有胃肠副作用，临床上约10%的服用者会出现腹泻。为了研究产生腹泻的机理，科学家采用的新方法非损伤微测技术结合传统方法研究了恩他卡朋造成腹泻的原因。

首都医科大学朱进霞实验室使用非损伤微测技术测定了Cl^-的流速，短路电流（ISC）测定了带电的离子运输，放射性免疫方法（RIA）测定了胞内的cAMP含量。发现恩他卡朋增加了大鼠末梢结肠粘膜的ISC和Cl^-分泌，顶端施加二苯胺2，2’-二羧酸（DPC）（一种Cl-通道抑制剂）显著抑制了ISC，基底外侧施用布美他尼（Na⁺-K⁺-2Cl^-（NLCC）共转运抑制剂）等显著抑制了Cl^-外流。消炎痛抑制内源前列腺素（PG）的合成，并且降低了粘膜下层肠神经的活性以及河豚毒素（TTX）抑制的恩他卡朋引起的ISC的增加和Cl-的分泌。

恩他卡朋刺激大鼠结肠cAMP依赖的Cl-的分泌，这个过程由内源的PG和粘膜下层肠神经系统所调节。这项研究比较完善地解释了恩他卡朋产生胃肠道不适应症的原因，即Cl^-大量分泌。

图注：恩他卡朋与粘膜下层细胞结合，导致cAMP的升高和PG、神经递质的释放，进而导致表皮细胞中的cAMP升高，打开Cl^-通道，促进Cl^-的分泌。

 

Li LS, et al.Entacapone promotes cAMP-dependent colonic Cl^- secretion in rats. Neurogastroenterology & Motility, 2011, 23: 657–e277. （2010 IF3.349）

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十四．大黄素诱导结肠的Cl^-分泌参与了肥大细胞和神经元的作用

大黄素（Emodin）是许多中药中泻药的活性成分。然而，它的活性机制还不清楚。

首都医科大学朱进霞实验室的使用非损伤微测技术等方法研究大黄素作用于结肠的作用机制，即它的利泻机制。发现大鼠结肠上皮细胞在大黄素作用下会出现较大的Cl^-外流（这一点与很多能引发腹泻的药物类似），而大黄素诱导的Cl^-外流与肥大细胞脱粒以及粘膜下胆碱能和非胆碱能神经元的激活密切相关。

中药药理药效的研究一直是一个难点，这也成为中药国际化的严重障碍。本文作者采用非损伤微测技术对中药有效成分药效的研究是非常有益的探索，基于非损伤微测技术的特点，该方法很可能成为研究中药整体药效的突破性手段。

图注：大黄素作用于结肠的模型图。大黄素刺激肥大细胞产生组胺，进而引起Cl-的分泌。

 

Xu JDet al. Emodin induces chloride secretion in rat distal colon through activation of mast cells and enteric neurons. British Journal of Pharmacology, 2012, 165: 197-207.（2010 IF 4.925）

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其他应用实例—植物学、动物学、医学、微生物学、环境科学、材料科学等

植物学--用NMT发现了质膜上新的Ca²⁺通道GLR

葡萄牙里斯本大学José Feijó教授研究组使用非损伤微测技术研究了氨基酸刺激后花粉管的Ca²⁺流动，发现谷氨酸受体类似基因（GLRs）减少了通过质膜的Ca²⁺内流，进而调节花粉管顶端胞质中的Ca²⁺浓度梯度，最终影响花粉管的生长和形态建成。此外，敲除花粉管丝氨酸消旋酶（SR1的突变体）后GLRs活性下降，导致生长发生缺陷。这些结果直接证实了植物中具有和动物中相似的神经传递系统。文章在在著名杂志《Science》封面以“Research Article”的形式发表。文中提到的“vibrating-probe measurements”是非损伤微测技术的一种。

Michard E, et al. Science, 2011, 332: 434 - 437.

动物学--青鳉尤鱼线粒体富集细胞NH₄⁺的吸收依赖于Na⁺的吸收

中国台湾的科学家使用非损伤微测技术对青鳉幼鱼皮肤表面线粒体富集细胞（MRCs）的H⁺、Na⁺和NH₄⁺的流速进行了测定，发现Na⁺/H⁺交换器（NHE）与Na⁺和NH₃/NH₄⁺的转运相关，提高胞外的NH₄⁺浓度显著抑制NH₃/NH₄⁺的分泌和Na⁺的吸收。相反，提高溶液的酸性可增强细胞对NH₃/NH₄⁺的吸收和Na⁺的分泌。Na⁺的吸收与NH₃/NH₄⁺的外排是通过淡水鱼的MRCs实现，也说明了与斑马鱼通过HRCs细胞对Na⁺的吸收作用机制不同。

WuSC, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2010, 298: C237 - C250.

 

医学

（1）骨骼研究

骨骼作为离子交换的器官

        《Bone》杂志报道了数名科学家使用非损伤微测技术测定生理状态下骨骼的Ca²⁺流，发现Ca²⁺在ECF溶液中出现内流，在无Ca²⁺的ECF溶液中出现外流，这种内外流的转变在整个实验期间都非常稳定。当添加10mM的NaCN时，10min之内Ca²⁺外流消失，说明这种外流具有细胞依赖性。这项研究为我们理解Ca²⁺在骨骼和胞浆中的平衡提供了依据，可以据此为人体补钙。

Marenzanaa M., et al. Bone, 2005, 37: 545 - 554.

 

（2）伤口愈合

电流激活伤口愈合的信号通路

加州大学的赵敏实验室使用非损伤微测技术研究了内生伤口的电流，测定了Na⁺、K⁺和Cl^-电流，发现电信号通过激活特定的酶，可以调控伤口愈合过程中细胞的迁移，并选择性地激活信号通路。

Zhao M, et al. Nature, 2006, 442: 457 -460.

 

微生物学

菌根化过程中的信号转导机制

葡萄牙的Feijó实验室使用非损伤微测技术研究了离子流在菌根生长过程中的作用，发现真菌侵染主要作用于根部伸长区，离子运动及根部酸化发生了剧烈变化，且离子流变化呈现周期性。通过这项研究他们构建模型解释了植物养分吸收和生长加速是通过侵染真菌所介导，依赖于pH的变化，发现Ca²⁺在这一过程中发挥了重要的作用，这为揭开植物和真菌共生互作提供了证据和模型。

Ramos AC, et al. New Phytologist, 2009, 181: 448 - 462.

 

环境科学

鱼胚胎耗氧流速作为环境监测的指标

普渡大学的科学家使用非损伤微测技术检测了鱼胚胎的O₂流，发现在微量有机污染物作用下，鱼类胚胎O₂内流量会显著改变。这是真正意义上的环境污染生物学监测手段，表明污染物的作用可能比原先预计要严重的多。这项技术可用于其他有机生命体，如果将胚胎鱼结合使用于瘤细胞，能够检测到潜在的致癌药物，或帮助发现新的治疗目标。这项研究非常令人欣慰，它能够成为保护人类健康的一项潜在应用工具。该研究采用非损伤微测技术来监测环境毒物的存在，为水质监测提供了新的思路和方法。

Sanchez BC,et al. Environmental Science & Technology, 2008, 42: 7010 – 7017.

 

材料科学

腐蚀机制和动力学研究

葡萄牙的科学家使用非损伤微测技术检测了镁合金在NaCl水溶液中的腐蚀行为，对镁合金的腐蚀机制进行了精确清晰的描述，这项技术为研究金属材料微区域电化学腐蚀过程的机制和动力学提供了一个有力的工具。

Lamaka SV, et al. Electrochemistry Communications, 2008, 10: 259 - 262.

 

 

非损伤微测技术与其他技术的结合

（1）与膜片钳技术的结合

离子通道调节细胞凋亡早期的K⁺外流

墨西哥和澳大利亚的科学家使用非损伤微测技术和膜片钳技术研究了细胞凋亡，发现1μM STS（十字孢碱）会快速引起K⁺外流，同时记录到Kbg通道的电流增加，伴随着膜去极化的急剧下降。Kbg通道调节早期的K⁺外流，Kv1.3通道在后期起到主要作用。这一研究为认识细胞凋亡的内在机制提供了新的证据，这种实时和便于操作的研究手段有望在临床等实际应用领域诊断或检测凋亡细胞。

Valencia-Cruz G, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2009, 297: C1544 - C1553.

 

（2）与荧光/激光共聚焦技术的结合

胞外的Ca²⁺内流参与了胞内Ca²⁺的增加

葡萄牙的Feijó实验室使用激光共聚焦显微镜技术测定了细胞内Ca²⁺的同时结合使用非损伤微测技术测量了进出细胞的Ca²⁺流。细胞融合一旦发生，使用非损伤微测技术测得一个显著的Ca²⁺内流，直接验证了胞外的Ca²⁺的参与了胞内Ca²⁺的升高这一生理过程。

Antoine AF, et al. Nature Cell Biology, 2001, 3: 1120 – 1123.

 

 

 

附件二、FAQ

 

1. 非损伤微测技术是一种什么样的技术？

非损伤微测技术是在近似生理条件的液体环境里，通过实时测量离子或分子进出活体材料的动态流速，反映该材料相关基因和蛋白质生理功能的技术。 对活体材料进行实时动态的测定是生命科学的发展趋势，也是科学仪器的发展方向。

非损伤微测技术是实时、动态的测定活体材料的技术，通过测定进出活体材料的离子和小分子的流速这一指标反映生命活动，是生理功能研究的最佳工具之一。

非损伤微测技术与其他活体测定技术有所不同，不受被测材料的限制，能够获得离子和小分子的空间运动大小和方向，具有广阔的应用前景。

 

2.非损伤微测技术测定的指标是什么？

非损伤微测技术测定的是离子和小分子的流速，包括离子和小分子流动程度的大小和流动的方向，具有时间性和空间性的特征，即流速能够反映离子和小分子的流动行为随着时间、空间变化而产生的改变。

非损伤微测技术目前测定已经非常成熟的离子有：Ca²⁺、H⁺、Na⁺、K⁺、Cl^-、NH₄⁺、NO₃^-、Cd²⁺、Mg²⁺；小分子有：O₂、H₂O₂。

更多的离子和小分子的测定在进一步开发中，如IAA、NO、Glucose、Zn²⁺、Fe³⁺等。

非损伤微测技术获得的流速的单位是：10^-12 mol · cm^-2 · s^-1

 

3. 什么是流速（flux）？

3.1 广义的流速

流速是指物质在介质和空间中运动的速度，具有方向性和时间性。

3.2 狭义的流速

流速是指生物体由于内外交换形成的离子和小分子梯度中离子和小分子的运动速度。

注：这里的流速是指生命科学中的流速（flux）。

 

4. 流速的意义是什么？

4.1 流速是活细胞的语言

流速是活细胞信号转导过程的直观反映，是活细胞的语言。

4.2 流速是信号转导/功能的桥梁

流速是基因发挥功能的桥梁，基因表达的指令通过物质的流动进行传递。

4.3 流速是活体生命的本质特征

流速是活体生命的本质特征。

流速概念的引入，推动了生命科学研究从依赖大量前处理实验的传统模式飞跃到简便的活体和动态测量模式，测定流速的工具非损伤微测技术与活体成像技术成为这一模式下最为突出的两项技术。活体测量和活体研究极大地改变了人类对生命活动的认识。

 

注释：

• 实时：快速（以秒为单位）获取、呈现和记录数据
• 动态：长时间、连续不断地测量和获取数据
• 活体材料：具有生命的材料

 

5．应用非损伤微测技术的论文在哪些刊物上发表过？

据不完全统计，非损伤微测技术诞生以来已经在SCI收录的50多种刊物上发表了300多篇论文，以下是一些较有影响力的刊物的名称。

Science、Nature、Nature Protocols、Nature Cell Biology、New Phytologist

PNAS、Plant Cell、Plant Physiology、Plant Journal、Plant, Cell and Environment、Plant Cell and Physiology、Planta、Physiologia Plantarum、Protoplasma、Plant Signaling & Behavior、Plos

Journal of Cell Biology、Journal of Biological Chemistry、Journal of Experimental Botany、Journal of Experimental Biology、Journal of Microbiological Methods、Journal of Biological Engineering、Journal of Neurochemistry、Journal of Neuroscience、Journal of Cell Science、Journal of Physiology、Journal of Membrane Biology

American Journal of Physiology-Cell Physiology、Applied and Environmental Microbiology、Aquatic Toxicology

Biology of Reproduction、BMC Plant Biology、Bone、Biological Bulletin、Biophysical Journal、Biotechnology and Bioengineering、Comparative Biochemistry and Physiology、Diabetes、Development

Eukaryotic Cell、Environmental Science & Technology、FASEB Journal、FEMS Microbiology、Functional Plant Biology

Microbiology、Molecular Neurodegeneration、Molecular Biology of the Cell

Zygote

 

6.从哪里可以购买非损伤微测技术的实验设备——非损伤微测系统？

非损伤微测系统在中国大陆的销售工作由各地经销商负责，目前经销商网络已经覆盖了全国大部分省市自治区。您可以直接联系非损伤微测系统的的本地经销商，如果不清楚谁是经销商请直接联系旭月（北京）科技有限公司（以下简称旭月公司），由旭月公司代为安排。

 

7. 目前有哪些单位购买了非损伤微测系统？

目前国内已经售出十余套非损伤微测系统，包括中国农业科学院下属单位2套、中国科学院烟台海岸带研究所1套、中国林业科学研究院下属单位1套、暨南大学1套、北京林业大学1套、首都师范大学1套、北京市农林科学院下属单位1套及台湾中央研究院下属单位2套。此外，还有超过100位客户以接受测试服务的方式使用非损伤微测系统，这些客户来自北京大学、清华大学、中国农业大学、中国科学院、中国农业科学院、浙江大学、南京农业大学、山东农业大学、山东师范大学、中国人民解放军总医院（301医院）、广州中医药大学、河南大学、厦门大学等全国各地的知名高校和研究机构。

 

8. 非损伤微测系统的售后服务水平如何？

旭月公司拥有一只优秀的售后服务团队，除公司自身经验丰富的技术工程师外，很多国内外知名学者应邀担任了旭月公司的顾问，他们共同为客户提供各种形式的优质售后服务。

旭月公司制定了完善的售后服务流程和规章制度，客户使用非损伤微测系统使用时出现的任何问题联系旭月公司后，旭月公司都会在第一时间提供问题的解决方案。

 

9. 非损伤微测系统能使用多长时间，后续的耗材、试剂贵吗？

非损伤微测系统自身的稳定性极高，使用寿命很长。目前市场在售的非损伤微测系统都是美国原装进口的产品，经过厂家严格检验，质量有保障，完全可以按照国家规定的固定资产最高使用年限估计使用寿命。

非损伤微测系统专用电极

 

相比生命科学领域其他常见仪器，非损伤微测系统后续的耗材、试剂很便宜，完全在可承受的范围内，对此已经购买了非损伤微系统的客户深有体会。

 

10. 如果我暂不购买非损伤微测系统，但希望开展相关的实验，是否有可行的办法？

上文中提到的测试服务非常适合于您。旭月公司设有测试服务中心，只要您设计好实验方案，将实验样品和其他去辅助材料拿到测试服务中心，就可以比较低廉的价格使用中心的非损伤微测系统开展实验。中心配备了专业的技术工程师，无需您亲自操作系统。具体情况请参考旭月公司主页“测试服务”模块或直接咨询旭月公司。

 

11. 非损伤微测系统可测量的对象有哪些？目前测试中心已检测过的样品有哪些？

非损伤微测技术可测量样品的范围较广：整体→器官→组织→细胞层→单细胞→细胞器（富集）。

迄今为止，测试中心测试过的样品种类已超过百种，包括植物类、动物类、微生物类以及非生物类。

植物类：如根、叶片、花粉管、保卫细胞、液泡等。

动物类：如胚胎、胰岛、耳蜗组织、卵细胞等。

微生物类：如丛枝菌根、大肠杆菌、根瘤菌等。

非生物类：如镁合金、陶瓷、碳钢、铝合金等。

 

12. 非损伤微测技术实验涉及到的测试液和校正液是什么？测试液和校正液设计时需要遵循的原则有哪些？

测试液是指测试时样品所处的液体环境。

校正液是指用来校正电极的溶液，原则上尽量和测试液相似。高浓度校正液和低浓度校正液的待测离子浓度范围应该是包含测试液中待测离子的浓度，高低校正液浓度一般相差10倍（一些分子除外）。

注意：测试液中的离子浓度是指溶液所有成分中同一种离子的浓度总和。

 

测试液和校正液设计时需要遵循以下原则：

（1）测试液可尽量和样品的培养液一致，保证样品的活性。

（2）测试液中应该含有所测定的离子（特殊的研究，如先用没有所测定离子的溶液，然后再加入此种离子的实验情况除外）。

（3）测试液中待测离子的浓度不宜过高，尽量维持在一个较低的水平（例如1mM以内）。

（4）测试液尽量维持一定的渗透压和pH值，以保证样品的活性。

（5）不同的校正液之间的浓度一般相差10倍（特殊的分子除外）。

（6）测试液和校正液最好用相应成分的母液（例如：100倍的母液）稀释进行配制，避免直接称量误差较大，导致浓度不准确，影响校正和测试。

（7）测试液和校正液pH的调节需注意，不能用含有待测离子的酸或碱调节，如测定Na⁺时调节pH值不能用NaOH，否则就使溶液中的Na⁺含量增加，可用较少量的KOH调节，最好用氯化胆碱或Tris。

 

13. 非损伤微测技术实验中获取的数据是什么？它们的含义是什么？

通过实例予以说明：下图为非损伤微测系统同时测定植物根K⁺和H⁺的流速时数据采集软件的截图。

图中红色的线代表H⁺，绿色的线代表K⁺，所记录数据为样品离子的流速或者是距样品两点间的电压差ΔV（μV）（纵坐标），横坐标为记录的时间，在零线上方（正值）的曲线是指离子外流（Efflux），零线下方的曲线是指离子内流（Influx），白色点是指进行了一个刺激处理，当受到刺激处理后，H⁺和K⁺的外流增加。

 

14.如果非损伤微测技术实验数据不够理想，一般是什么原因造成的？如何发现问题？

数据不够理想的最可能原因是被测样品的活性状态不佳，其次是配制的测试液存在问题。当然也可能是测试系统本身存在故障，但这种可能性很小，而且很容易及时发现和纠正。

为确认测试中问题产生的原因，可进行人工离子源实验。在相应的测试溶液中进行人工离子源实验，若能观察到正常浓度梯度反应曲线则基本可以排除系统故障的可能性。

注意：样品间某些离子可能存在个体间的差异，因此测试时会出现重复性不好的情况，这种情况需要从样品和测试液本身入手寻求解决的办法。

 

结束语

 

在编写完第二册非损伤微测技术论文集的时候，深刻地体会到了非损伤微测技术在国内科学研究中应用的广泛性，从当初的植物领域发展到医学、环境领域，越来越多的成果具有重要的创新性，无论是学科交叉，还是发现基因的新的功能，或者建立的新方法，都为我们的研究提供了重要的参考，推动了科研继续向前发展。

我们的研究从认识细胞开始。如何测定细胞与外界的交换过程，尤其是实时和活体测定，是我们在研究手段上面临的最终目的。非损伤微测技术的实时与活体测定的特点，为认识细胞的作用提供了非常有效的手段。液泡，是植物中最重要的离子平衡的调节器官，长久以来，实时获取它对离子的调节过程，是科研的难题，从早期简单地测定液泡的Ca²⁺起，很多人并没有解决液泡离子流速的测定问题。中科院植物所李银心实验室通过多次实验，并且结合多种修正方法，使用非损伤微测技术准确地测定了烟草液泡的H⁺流速，且发现和证实了H⁺流速的变化与液泡膜上的酶活性密切相关。这为我们认识细胞打开了一扇便捷的大门。

在2011年，从烟草液泡的离子流测定，到拟南芥保卫细胞的测定，再到胡杨愈伤细胞的测定，都体现了非损伤微测技术在研究细胞离子流方面的优势，这些结果几乎都是首次的发现。另外对基因的研究，也一次又一次地发现和证实了基因在生理状态下的功能，丰富了功能基因组学的研究成果。植物逆境、重金属胁迫以及学科交叉与药物作用机理的研究，都在这里得到集中体现。

期望这本第二册非损伤微测技术论文集的面世，为广大的科研人员提供有益的参考，快速促进非损伤微测技术的应用。

 

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