Proceedings of Non-invasive Micro-test Technology (NMT)

in China

(Issue No. 1, 2011)

 

非损伤微测技术论文集

 (第一册)

 

 

 

 

旭月（北京）科技有限公司

2011年3月

北京

 

序

 

        2007年，当我又回到麻省州立大学生物系，看望我昔日的导师之一Peter Hepler教授时，我向他介绍了在北京设立的“非损伤微测技术测试中心”，他不无感慨地说到：“我看5到10年，世界植物学的研究中心将从美国转移到中国！”。

        众所周知，中国植物学的研究已经处于世界前列，近些年的发展势头尤其迅猛，以至于像Hepler教授这样的美国资深科学家也感受到了冲击和压力。今天，这本《非损伤微测技术论文集》的面世，不仅是对这种趋势的进一步印证，也是对于本书中那些敢为人先的科研人员的肯定。同时，我要感谢老一辈科学家匡廷云院士、杨福愉院士、林克椿教授、叶鑫生教授、赵微平教授和邱泽生教授的培养，以及中青年科学家武维华院士、种康研究员、刘春明研究员和杨维才研究员等人的指导。我坚信在大家的共同努力奋斗下，中国的植物学研究必将继续突飞猛进，而旭月公司十分荣幸地能够在这一历史进程中贡献自己微薄的力量。

  

 

                                                                                                                   许  越

                                                                                                       2011年3月于美国麻省

 

前  言

        对活体材料进行实时、动态的测定和研究是生命科学发展的趋势，也是后基因组学时代科学研究的重点。

        非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technology，NMT)是实时、动态测定活体材料的技术，通过测定进出活体材料的离子和小分子的流速反映生命活动的规律，是生理功能研究的最佳工具之一。

        非损伤微测技术起源于产生了多位诺贝尔奖获得者的美国海洋生物学实验室（Marine Biological Laboratory，MBL），由MBL的神经科学家Lionel F. Jaffe于1974年在《Journal of Cell Biology》杂志上提出原初概念，于1990年成功应用于测定细胞的Ca²⁺流速，开创了生命科学从静态测量到动态测量转变的先河。

        与传统技术只能测定静态浓度相比，非损伤微测技术能够选择性地获取样品的离子和小分子的动态流速（流速达到10^-12 mol • cm^-2 • s^-1），可以探知传统电极技术无法检测到的信息，是研究活体生命功能必不可少的技术之一。非损伤微测技术与其他活体测定技术有所不同，不受被测材料的限制，能够获得离子和小分子的空间运动方向，具有广阔的应用前景。

        自从非损伤微测技术发明以来，国外的研究机构如美国的海洋生物学实验室（MBL）、普渡大学（Purdue University）、康奈尔大学（Cornell University）、麻省州立大学（University of Massachusetts）、威斯康星大学（University of Wisconsin）、宾夕法尼亚大学（Pennsylvania State University）、加州大学（University of California），英国的剑桥大学（University of Cambridge），葡萄牙的里斯本大学（Universidade de Lisboa），澳大利亚的塔斯马尼亚大学（University of Tasmania）等单位使用非损伤微测技术在《Nature》、《PNAS》、《Journal of Cell Biology》、《Plant Cell》、《Environmental Science & Technology》等杂志发表了大量科研成果。非损伤微测技术的活体、动态和实时的测量方式，以及高分辨率和高灵敏度，将促进人类在科研领域的工作，加深对自然界的认识。

        2005年非损伤微测技术进入中国，以北京林业大学陈少良实验室、中科院植物所林金星实验室和北京生命科学研究所郭岩实验室为先导，首先使用非损伤微测技术做了前期工作，他们的工作随之发表在《Plant Cell》和《Plant Physiology》杂志，为国内非损伤微测技术的应用奠定了基础。

        近两年，非损伤微测技术发展迅猛，在生命科学的各个领域有所应用，为科学研究提供了一种可视化的手段，解决了众多科学问题，如基因和蛋白在活体中的功能、植物应对逆境的策略、细胞发育的机制等。但是在植物学领域中的应用最为广泛，取得的成果也最为突出。因此，我们在2011年新年之际编写这部论文集，以近年来中国科学家使用非损伤微测技术在国内外著名刊物上发表的13篇研究论文为主要内容，附加部分解读，期望为中国的科研人员提供非损伤微测技术研究的参考。

        此外，美国扬格公司与旭月(北京)科技有限公司合作在中国进行生产组装的工作，现在也结出了成果。自行组装的非损伤微测系统自2007年在公司测试中心投入运行后,经受住了长时间高负荷工作的考验,本论文集论文中的相当一部分实验数据就是在自行组装的非损伤微测系统上获得的。所以我们完全有理由相信，随着美国技术中国组装的“非损伤微测系统”的推出，会使更多的科研机构突破设备价格的限制，将我国科研人员“非损伤微测技术”的应用推向更高的水平。

 

 

一．NaCl诱导杨树根细胞和组织离子流的转换

土壤的盐碱化很严重，引起了诸多农业和环境问题。如何研究植物对盐碱胁迫的反应，寻找能够抵御盐碱胁迫的植物品种，是我们应对土壤盐碱化的手段之一。盐胁迫 对植物影响的机制在过去进行了大量研究，然而，木本植物的盐胁迫以及抗盐研究，不但难度大，而且对于机理的认识停滞不前。

北京林业大学陈少良实验室使用“非损伤微测技术（SIET）”测定了抗盐品种胡杨和盐敏感型品种群众杨根、细胞和原生质体的H⁺、Na⁺和Cl^-流速，比较了短期处理和长期处理后两个品种间排Na⁺的能力。长期胁迫导致根原生质体Na⁺外流增加，H⁺内流增加。这种NaCl诱导的Na⁺/H⁺交换被Amiloride和矾酸钠抑制，说明胁迫后胡杨Na⁺的排出是Na⁺/H⁺反向转运体主动跨膜的结果。相比较而言Na⁺/ H⁺反向转运体在盐胁迫后的群众杨根组织和细胞水平都缺乏。此外，盐胁迫的胡杨根中保留着比群众杨更高的排Cl^-能力。胡杨根中NaCl诱导的H⁺、Na⁺和Cl^-流与等渗甘露醇所引起的离子流不同，表明离子流的转变主要是由离子效应引起。

这项研究通过非损伤微测技术获得了杨树在盐胁迫下的H⁺、Na⁺和Cl^-流的图谱，发现了抗盐性的胡杨具有很强的排Na⁺和排Cl^-的能力，以及Na⁺/H⁺反向转运体的活性，这是胡杨能够忍耐高盐胁迫的关键因素之一。同时，这项研究建立了系统的植物逆境研究的非损伤微测技术实验方法，为本领域的研究奠定了基础。

 

图注：pH影响胡杨根原生质体的净Na⁺和H⁺流速，离子流在5.5，6.0，7.0的条件下测定。

Sun J,et al. NaCl-induced alternations of cellular and tissue ion fluxes in roots of salt-resistant and salt-sensitive poplar species. Plant Physiology, 2009, 149: 1141 - 1153.

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二．分子伴侣J3通过PKS5的相互作用调节质膜H⁺-ATPase的活性

质膜H⁺-ATPase在植物响应盐碱胁迫，维持体内离子平衡中起着重要的作用。因此，阐明质膜H⁺-ATPase活性的调节机制，对于我们理解植物响应盐碱胁迫的反应至关重要。以前的研究发现，拟南芥蛋白激酶PKS5抑制质膜H⁺-ATPase的活性，进而负向调节植物的盐碱胁迫反应。

2010年，北京生命科学研究所的郭岩实验室在《Plant Cell》报道了一个分子伴侣J3能够激活PM-H⁺-ATPase，且抑制PKS5的活性。当植物缺乏J3时对外部的盐碱胁迫超敏感，PM-H⁺ATPase的活性也下降。使用非损伤微测技术在活体拟南芥的根部进行了原位测量，证实不同的基因所调控的质子外流（H⁺efflux）的差异，说明了蛋白之间的相互作用。本研究发现，分子伴侣蛋白J3可以和PKS5相互作用，并且抑制PKS5激酶活性，进而正向调节质膜H⁺-ATPase的活性及植物对盐碱胁迫的反应。

本研究鉴定了一个新的PKS5信号转导途径的成分正调控PM-H⁺-ATPase的活性，PM-H⁺-ATPase的磷酸化状态对拟南芥应对环境刺激非常重要。这些工作揭示了拟南芥中的分子伴侣蛋白J3通过抑制蛋白激酶PKS5活性参与调节PM H⁺-ATPase的活性及植物盐碱胁迫反应的机理。

图注：拟南芥的表型图和采用非损伤微测技术测定不同基因型拟南芥根部的质子流（H⁺flux）的结果图。

Yang Y, et al. The Arabidopsis chaperone J3 regulates the plasma membrane H⁺-ATPase through interaction with the PKS5 kinase.Plant Cell, 2010, 22: 1313 - 1332.

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三．H₂O₂引发的Ca²⁺通过质膜H⁺转运系统调节NaCl胁迫下的K⁺/Na⁺平衡

植物在高盐环境下，保持体内的离子平衡对生命活动至关重要，抗盐植物具有很强的保持K⁺/Na⁺平衡的能力，并且能够忍耐盐害。然而，K⁺/Na⁺平衡如何通过信号转导去调控，以及H₂O₂在其中发挥怎样的作用一直不清楚，尤其是活体上的信号机制。2010年，北京林业大学的陈少良实验室研究了胡杨在NaCl胁迫下H₂O₂、Ca²⁺调节的质膜H⁺结合转运系统的信号转导途径控制的K⁺/Na⁺平衡，提出了胡杨盐胁迫信号转导途径的模式图。

本研究使用非损伤微测技术（SIET）和激光共聚焦技术测定了细胞内外以及进出细胞的离子，发现NaCl引起K⁺的外流是因为盐诱导了膜的去极化，同时在质膜上发现了Na⁺/H⁺反向转运体。DPI或者DMTU抑制了H₂O₂的产生，因而引起K⁺外流增加和Na⁺/H⁺反向转运体活性下降。NaCl诱导了Ca²⁺内流，引起胞内Ca²⁺升高，Ca²⁺的升高促进了H₂O₂调节的K⁺/Na⁺平衡。结果表明，质膜H⁺结合转运系统（H⁺-ATPase、Na⁺/H⁺反向转运体和Cl^-/2H⁺共同运输体）调节H⁺的转换，促进了H₂O₂和Ca²⁺的信号转导，因而通过调控K⁺通道和Na⁺/H⁺反向转运系统来达到K⁺/Na⁺的平衡。非损伤微测技术在本研究中是获得离子跨膜流动信息的必不可少的工具。

这项研究提出了一个胡杨细胞盐胁迫信号转导途径的模式图，为认识植物如何调节K⁺/Na⁺平衡进行抗盐的机理提供了新的证据。

图注：胞外的H₂O₂影响胞内的Ca²⁺浓度和膜电势；NaCl胁迫下胡杨细胞和原生质体Ca²⁺、K⁺、H⁺的流速图。

Sun J, et al. H₂O₂ and cytosolic Ca²⁺ signals triggered by the PM H⁺-coupled transport system mediate K⁺/Na⁺ homeostasis in NaCl-stressed Populus euphratica cells. Plant, Cell & Environment, 2010, 33: 943 - 958.

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四．钙调素（CaM）调控Ca²⁺内流影响花粉管的发育

钙调素(CaM) 是调控细胞中各种代谢和信号途径的重要功能分子。然而对在Ca²⁺-CaM的信号转导过程中的蛋白质表达模式和细胞结构的变化却了解不足。

2009年2月，中科院植物所林金星研究组在《Plant physiology》发表文章，使用电镜技术、蛋白质组学技术、荧光技术结合非损伤微测技术提供了全面的结果，分析了CaM的功能和蛋白表达模式。发现抑制Ca²⁺-CaM时快速诱导了胞外Ca²⁺的内流，导致胞内Ca²⁺浓度的急剧增加和花粉管超微结构的异常，随后肌动蛋白丝解聚，内吞和胞外分泌紊乱，细胞壁结构改变，最后导致花粉管生长混乱。

这项研究的结果能够从信号转导的相互关系、能量产生途径和伸长机制方面深入理解Ca²⁺-CaM在裸子植物花粉管发育中的功能。

图注：TFP处理引起了胞外Ca²⁺内流和胞内Ca²⁺浓度升高

Chen T, et al. Combined proteomic and cytological analysis of Ca2+-calmodulin regulation in Picea meyeri pollen tube growth.Plant Physiology, 2009, 149: 1111 - 1126.

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五．胞外的Ca²⁺内流影响花粉管的发育

Ca²⁺是花粉管萌发和生长中的重要离子。然而，如何通过Ca²⁺信号转导和细胞骨架的相互作用来控制花粉管的发育、能量供给途径和细胞扩展的过程了解不够。

2008年，中国科学院植物研究所林金星实验室在《Journal of Proteome Research》发表题为“Integrative proteomic and cytological analysis of the effects of extracellular Ca²⁺ influx on Pinus bungeana pollen tube development”的研究论文。他们应用“非损伤微测技术”、整合蛋白质组和细胞分析方法研究了白皮松花粉管发育时期胞外Ca²⁺内流情况。用Nif（硝苯地平）处理生长中的白皮松花粉管，发现引起了蛋白质的差异表达和Ca²⁺功能的改变。Nif抑制花粉管膜上的L-型Ca²⁺通道，短时间内诱导了很多早期的变化，包括胞外Ca²⁺内流减小，胞质自由钙离子浓度快速下降，伴随着超微结构的异常、与能量和信号转导相关的蛋白质丰度的变化。之后出现肌动蛋白丝解聚，胞吞和胞吐模式改变，细胞壁重新构建，这些过程都涉及到蛋白质的变化。这个结果说明胞外的Ca²⁺内流是维持白皮松花粉管尖端Ca²⁺梯度的必须过程，Nif导致ATP产生减少，细胞骨架解聚，胞吞和胞吐异常，这些变化共同促进了细胞壁的改变，从而提高花粉管应对Nif反应的能力。

这项工作提供了花粉管极性生长中Ca²⁺功能的全新观点，对于认识药物如何通过Ca²⁺的作用从而导致细胞发生变化提供了可能的机制。

 

 

Wu X, et al. Integrative proteomic and cytological analysis of the effects of extracellular Ca²⁺ influx on Pinus bungeana pollen tube development. Journal of Proteome Research, 2008, 7: 4299 - 4312.

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六．胞外CaM的结合位点与功能

钙调蛋白（CaM）是一种高保守性的细胞内钙离子感应器。在植物中，胞外CaM也作为一个多肽信号影响许多生理功能，但是其在细胞质外的结合位点至今仍存在争议。

2009年5月，中科院植物所林金星研究组在《JBC》上发表文章，研究人员利用CaM交联QD系统对植物细胞表面CaM结合位点进行单分子水平检测，发现QD-CaM能选择性的结合在质膜外空间，并且通过高分辨率透射电子显微镜进行了进一步定位，证实了胞外CaM结合位点确实存在于植物细胞膜表面，但在植物细胞壁上却没有CaM结合位点。此研究为钠米技术在植物细胞研究上的应用提供了有力的证据。此外，研究人员还利用显微注射、FRET以及非损伤微测（SIET）等技术证明了胞外CaM在与其胞外结合为点结合后，可以引起胞内第二信使Ca²⁺信号的增强，这些发现说明了植物胞外CaM可以通过介导跨膜信号而发挥其信号肽的功能。

图注：百合花粉CaM的定位以及原生质体质膜Ca²⁺流

Wang Q, et al. Calmodulin binds to extracellular sites on the plasma membrane of plant cells and elicits a rise in intracellular calcium concentration. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284: 12000 - 12007.

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七．NO调节花粉管生长中细胞内外Ca²⁺的变化和细胞壁构建

一氧化氮（NO）在植物的生长发育过程中具有非常重要的作用。近日，中科院植物所林金星研究组深入研究了裸子植物白皮松花粉管生长过程中，NO对Ca²⁺、微丝骨架、囊泡转运和细胞壁构建的调节作用。

NO作为重要的信号分子，参与调控花粉管极性生长。通过应用显微注射、非损伤微测、免疫荧光标记等技术发现NO释放剂促进花粉萌发和花粉管伸长，并且具有浓度效应，而抑制剂则抑制花粉萌发和花粉管生长，同时使花粉管顶端膨大，丧失极性；NO释放剂促进胞外Ca²⁺内流，顶端Ca²⁺浓度梯度增加，NO抑制剂抑制胞外Ca²⁺内流，顶端Ca²⁺浓度梯度降低。

此外，NO释放剂促进囊泡运输，使花粉管顶端微丝束解聚，NO抑制剂具有相反的作用，同时NO使花粉管顶端酯化果胶增加而酸性果胶降低。

在白皮松花粉管中，NO促进胞外Ca²⁺内流，从而维持胞内Ca²⁺浓度梯度，进而影响花粉管顶端微丝骨架的组装，促进囊泡运输，使花粉管顶端酯化果胶累积，最终促进花粉管的正常生长。通过Ca²⁺流和细胞学实验结果，全面地认识了NO在花粉管中极性生长中的功能。

图注：使用荧光标记技术和非损伤微测技术得到的花粉管尖端Ca²⁺在NO释放剂和抑制剂处理后的Ca²⁺含量以及Ca²⁺流的变化图。正值为外流，负值为内流。

Wang YH, et al. Nitric oxide modulates the influx of extracellular Ca2+ and actin filament organization during cell wall construction in Pinus bungeana pollen tubes.New Phytologist, 2009, 182: 851 - 862.

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八．肌动蛋白丝的分解诱导拟南芥根毛线粒体中的Ca²⁺释放

植物肌动蛋白是植物细胞生物学领域发展起来的热点，它涉及植物细胞的分裂机制、细胞运动、细胞器运动、细胞的极性、细胞空间形状的维持、物质运输等细胞功能。光、碰触、热、激素、病原攻击和许多的胞外刺激都可以引起肌动蛋白骨架的快速结构改变。肌动蛋白微丝在细胞信号转导中发挥着重要作用。

线粒体是一个沿着肌动蛋白丝移动的细胞器，是植物细胞中的钙库。线粒体的位置和移动依赖于膜骨架的相互作用，微丝骨架是否直接影响线粒体的功能和钙库依然不清楚。因此，为了证实肌动蛋白丝对线粒体钙库、胞质Ca²⁺浓度、线粒体Ca²⁺和胞质Ca²⁺的相互作用的影响进行了研究。

中国科学院植物研究所林金星研究组的研究人员使用“非损伤微测技术”等方法发现用latrunculin B（Lat-B）和Jasplakinolide (Jas)处理拟南芥导致根毛肌动蛋白微丝的聚合和解聚，减少了线粒体的膜电势和钙库。同时，这些处理诱导了胞质Ca²⁺的瞬间增加，随后减少。所有的这些影响通过环孢菌素（cyclosporin A，Cs A，线粒体通透转换孔mPTP代表性抑制剂）前处理得到抑制。另外发现从根毛尖端到基部有线粒体的Ca²⁺浓度梯度，激动蛋白激活药物可以打乱这种梯度。

基于这些结果，研究者认为Lat-B或 Jas引起肌动蛋白丝的分解，促进mPTP不可逆的开放，导致线粒体中的Ca²⁺释放到胞质中，随之改变了胞质中的Ca²⁺浓度。因此，肌动蛋白丝的正常聚合和解聚根毛线粒体钙库所必须的过程。

 

Wang Y, et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca²⁺ release to the cytoplasm and [Ca²⁺]c changes in Arabidopsis root hairs.BMC Plant Biology, 2010, 10: 53 - 62.

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九．Ca²⁺调节杨树盐胁迫诱导的K⁺/Na⁺平衡

植物盐碱胁迫的研究近年来得到了很多关注，但是木本植物盐碱胁迫的研究难度很大。杨树是研究木本植物盐胁迫的代表植物。胡杨是一种耐盐性的杨树，具有维持K+/Na+平衡的能力，但是盐敏感的杨树不具有这种维持离子平衡的能力，导致氧化胁迫和盐伤害。如何提高盐敏感植物维持K+/Na+平衡能力，是我们提高植物耐盐的重要途径。

这项研究发现了胡杨中Na⁺/H⁺流速具有负相关，而群众杨中没有，通过添加Ca²⁺可以促进了群众杨中Na⁺/H⁺负相关性的形成，也提高了胡杨中Na⁺/H⁺的负相关性。这是植物抗盐的机制之一，也是提高植物抗盐性的便捷手段。

Sun J, et al.Calcium mediates root K⁺/Na⁺ homeostasis in poplar species differing in salt tolerance.Tree Physiology, 2009, 29: 1175 - 1186.

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十．NO调节H⁺-ATPase和Na⁺/H⁺ antiporter的活性增加红树对盐的分泌和Na+的区隔化

NO是重要的信号分子，但是NO也能提高植物的抗盐性。厦门大学郑海雷教授的研究成果《Nitric oxide enhances salt secretion and Na+ sequestration in a mangrove plant, Avicennia marina, through increasing the expression of H⁺-ATPase and Na⁺/H⁺ antiporter under high salinity》在《Tree Physiology》（2009 IF 2.292）杂志发表，通过“非损伤微测技术”测定Na+流速揭示了NO如何提高植物抗盐的机理。

NO通过促进盐胁迫下盐的分泌和Na+在液泡中的区隔化调节离子平衡，这项工作研究了红树白骨壤盐分泌的调节机制。实验中用400mM的NaCl处理，然后用100µM SNP处理，显著增加了盐晶体的密度和盐从叶片分泌的速度，使叶片中的Na+/K+比率变低。使用X-ray测定了叶片中的元素含量，发现100µM的SNP显著增加了表皮和皮下细胞的Na+积累，特别是盐腺中Na⁺/K⁺比率，但是对叶肉细胞没有显著的影响。使用“非损伤微测技术”测定了100µM SNP长期处理和30µM SNP瞬时下的盐腺，发现盐腺具有显著的Na+外流，相反地，NO合成酶抑制剂和清除剂导致Na+内流。这些结果表明NO通过增加盐腺的Na⁺外流促进了盐的分泌。SNP刺激了PM H⁺-ATPase和液泡膜Na⁺/H⁺反向转运体蛋白的表达，进一步清晰了NO促进盐分泌和Na+的区隔化的分子机制。

这项研究提供了NO调控盐腺Na⁺外流的直接证据，说明NO通过增加HA1和SOS1基因的表达、盐分泌和Na+外流提高红树对盐的忍耐，而且NO能够增加VHA-c1和NHX1基因的表达，诱导Na⁺进入表皮和下表皮的液泡中。NO调节的PM H⁺-ATPase和液泡膜Na⁺/H⁺反向转运体的活性与盐忍耐密切

Chen J, et al.Nitric oxide enhances salt secretion and Na⁺ sequestration in a mangrove plant, Avicennia marina, through increasing the expression of H⁺-ATPase and Na⁺/H⁺ antiporter under high salinity. Tree Physiology, 2010: 30, 1570 – 1585.

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十一．NH₄⁺外流和GMPase的活性调节高铵抑制的根尖生长

NH₄⁺是主要的氮源，不仅是活细胞必需的营养，而且是代谢过程中普遍的中间产物。然而，过量的NH₄⁺却对植物产生严重的毒害。植物根的生长对高胺很敏感，NH₄⁺对初生根的生长是必须的，但是高胺会抑制根的生长。这种抑制作用发生的机理一直没有得到明确的解释。

2010年，中科院南京土壤所的施卫明等人使用非损伤微测技术结合根的分区处理系统，研究了高胺毒害的机理。发现高胺抑制初生根的生长，关键是抑制了细胞分裂，但是原来的细胞还可以伸长。通过DR5:GUS的突变和表达发现生长抑制不依赖生长素和乙烯的信号转导。使用非损伤微测技术沿着初生根测定了NH₄⁺的流速，发现提高外界NH₄⁺浓度刺激了伸长区NH₄⁺的大量外流，同时根的伸长也受到抑制。这种NH₄⁺的外流在超敏感突变体vtc1-1中更显著，在GMPase的突变体中缺乏，因此，限制跨膜的NH₄⁺流和GMPase的功能能够显著降低拟南芥对NH₄⁺毒性的反应。

这项工作为植物的铵盐毒害提供了理论解释，对理解营养吸收和其他非生物胁迫有非常重要的参考价值。

 

 

图注：NH₄⁺对根尖生长素报告基因DR5:GUS的影响；NH₄⁺对分生区和伸长区NH₄⁺flux的影响。

 

Li Q,et al. Root growth inhibition by NH4+ in Arabidopsis is mediated by the root tip and is linked to NH4+ efflux and GMPase activity. Plant, Cell & Environment, 2010, 33: 1529 - 1542.

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十二．NO促进重金属Cd²⁺的吸收和累积加速烟草细胞的凋亡

NO是一种重要的生物活性气体和功能分子。在植物遭受生物和非生物胁迫下，包括重金属Cd²⁺时NO作为信号分子起作用。Cd²⁺是一种非必需和有毒的重金属，能够引起植物的细胞程序性死亡（PCD）。

中国科学家使用非损伤微测技术等方法研究了烟草BY-2细胞暴露在150µM的CdCl₂中出现PCD的调节因素。发现Cd²⁺诱导PCD出现时伴随着NO含量的显著增加。施加NO释放剂SNP可以加速PCD，也可以促进Cd²⁺的内流，导致胞内Cd²⁺的更多积累。NO合成酶抑制剂L-NAME和NO特异清除剂cPTIO缓解了Cd²⁺引起的毒性，降低了Cd²⁺进入细胞的速率，减少了胞内Cd²⁺的累积，甚至是导致Cd²⁺外流。基于这些发现，认为NO通过调节Cd²⁺的吸收和促进Cd²⁺在BY-2细胞的积累导致Cd²⁺诱导的PCD中扮演着正调控的作用。

本研究使用非损伤微测技术直接测定了Cd²⁺的进出，第一时间获得了NO对Cd²⁺运输调节的证据，对于认识植物吸收Cd²⁺的调节机理非常重要，同时还可以根据这项研究寻找富集Cd²⁺的植物，为植物修复提供帮助。

图注：150µm CdCl₂处理6h后NO对烟草BY-2细胞Cd²⁺流速的影响

Ma W, et al.Nitric oxide modulates cadmium influx during cadmium-induced programmed cell death in tobacco BY-2 cells. Planta, 2010, 232: 325 – 35.

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十三．膜泡相关蛋白OsSEC27P 增强缺铁转基因烟草根的H⁺分泌

铁（Fe）是所有生命必需的微量元素，作为多种酶的必须成分，铁参与了电子传递链、呼吸链和光合作用等重要生命活动，起到电子受体和供体的功能。尽管Fe 在土壤中的含量较丰富(>6%)，但其通常以难溶的氢氧化铁形式存在，难以被植物利用。为提高铁的吸收，植物进化出多种机制，除了铁的吸收机理Ⅰ和机理Ⅱ外, 膜泡运输过程参与铁吸收及铁稳态的维持也有所报道。

2010年，首都师范大学印莉萍研究组在《科学通报》上报道了一个新的膜泡(vesicle)相关基因OsSEC27P，并对其功能进行了分析。基因芯片和实时定量PCR 证明，OsSEC27P 受缺铁条件诱导上调表达。在转基因烟草悬浮细胞BY-2 中表达的OsSEC27P-GFP 融合蛋白和FM4-64 共定位，证明OsSEC27P 蛋白主要集中于细胞内的膜泡中。OsSEC27P 过量表达的转基因烟草液体培养基的pH 明显下降，通过“非损伤微测技术(SIET)”证明是小苗根部缺铁响应的质子分泌显著加强所致。因此，膜泡相关蛋白OsSEC27P 在缺铁条件下，对增强根的H⁺释放起着重要的作用。

H⁺的外排是铁吸收过程的重要步骤，并且是一个连续的缓慢过程。非损伤微测技术具有的独特的空间及时间优势，已经成为离子或分子跨膜蛋白功能研究中一种不可或缺的实用技术。在这项工作中使用“非损伤微测技术”研究了转基因烟草根毛中膜泡相关蛋白OsSEC27P与质子外排之间的关系，为我们认识Fe转运机制提供了证据。

 

杨光 等, 膜泡相关蛋白OsSEC27P 增强缺铁转基因烟草根的H⁺分泌. 科学通报, 2010，55: 1233 – 1239.

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Simultaneous NMT Measurement of Ca²⁺ and H⁺ Fluxes Induced by Addition of H₂O₂

Calcium (Ca²⁺) and proton (H⁺) are key players in cell signal transduction and homeostasis. They modulate a variety of cellular activities including fertilization, development and apoptosis. Hydrogen peroxide (H₂O₂) is believed to be one of the triggers for apoptosis. Here, we present a method that uses Non-invasive Micro-test Technology (NMT®, www.xuyue.net) to simultaneously measure Ca²⁺ and H⁺ fluxes of porcine oocytes before and after H₂O₂ treatment. Our data show that H₂O₂ triggered Ca²⁺ and H⁺ influx and provoked a substantial cellular shrinkage. We speculate that extracellular addition of H₂O₂ could activate Ca²⁺ channel and lead to acidification of cytoplasm, by which induce cell apoptosis. The method can also be extended to simultaneously measure other combinations of either ion/ion or ion/molecule, such as H⁺/K⁺, Ca²⁺/K⁺, H⁺/O₂ with cells, tissues or organs. 详细内容请点击

控制氮磷比是减轻水体富营养化危害的重要途径——通过光纤技术监测富营养化

导致水体富营养化的主要因素是氮，还是磷，或者是氮磷比，长期以来存在一定的争论。本研究通过最新研发的非损伤微测技术——光纤技术实时监测了氮和磷处理下水稻根部耗氧量的变化，研究发现高磷是引起耗氧量大幅度增加的主要因素，而维持一定的氮磷比可以减缓耗氧量的增加。因此，在治理水体富营养化过程中控制合适的氮磷比可以有效避免富营养化带来的危害。详细内容请点击

 

活体生物监测与研究水环境的新技术：非损伤微测技术

水环境问题是人类面对的最重要问题之一，而且随着水资源的日趋短缺，显得越发重要。

监测水中污染物对生物体的影响是我们了解水质质量的最佳手段之一，使用非损伤微测技术监测呆头黑鱼胚胎在常见污染物处理后的氧气流速（O₂ flux），如除草剂阿特拉津（atrazine）、重金属CdCl₂、氯苯酚(pentachlorophenol，PCP)和 KCN，在极低浓度之下即可引起鱼胚胎呼吸的显著改变，这种改变会导致鱼受到伤害。因此，可以通过这种手段建立一种预警系统进行水环境质量的监测，也为人类饮用水的安全提供了一种可能的监测手段。详细内容请点击

 

赤霉素引起的K⁺、Ca²⁺和H⁺动力学的直接测量

赤霉素（Gibberellins）通过调节Ca²⁺依赖的蛋白激酶（CDPK）的表达，促进胞内Ca²⁺的增加，增强质子泵的活性，引起细胞壁扩展，细胞伸长，从而达到调节植物生长的目的。利用非损伤微测技术（Noninvasive Micro-test Technology, NMT, www.xuyue.net）检测何氏凤仙花（Impatiens holstii Engler et Warb.）根部分生区域的K⁺、Ca²⁺和H⁺三种离子的动力学，发现100μM的赤霉素（GA3）能够引起K⁺短时间内大量的内流，Ca²⁺和H⁺的持续的内流（如图所示）。详细内容请点击

 

 

SIET和LSCM结合在植物逆境生理研究中的应用

扫描离子选择微电极技术（SIET）能够利用特异性离子电极，在不接触被测样品的情况下获得进出样品的各种分子/离子（如K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Cl^-，H⁺，O₂等）的浓度、流速及其运动方向的信息，该技术已在世界范围内得到广泛应用，尤其是在植物科学领域。激光共聚焦显微镜（LSCM）技术是当今活跃在生命科学领域作为活细胞定量分析，荧光定量分析以及显微二维及三维空间结构观察分析的代表性技术和主要实验方法工具，已广泛应用于细胞生物学、分子生物学、神经科学、遗传学、植物学、病毒学及临床医学等学科的科研工作中。本研究将SIET和LSCM结合，应用在植物细胞响应NaCl胁迫的信号转导研究中。详细内容请点击

 

 

Reveal the 3D Nature of Ionic Activities with NMT (Non-invasive Micro-test Technology)

Activities of extracelluar ions and molecules are involved in many essential physiological functions in both animal and plant cells. Therefore, developments of electrochemical sensors which can selectively measure H⁺, Ca²⁺, K⁺, Na⁺, Cl^-, Mg²⁺, Cd²⁺ and O₂ etc., have made significant contributions in the research of biomedical sciences. However, most information of these ions/molecules is limited to 1D or 2D so far. Here we introduce a method to plot the ionic/molecular activities in 3-Dimensional fashion by which more detailed and accurate information of these ions/molecules can be revealed. 详细内容请点击

 

 

机械物理刺激引发的拟南芥根部H⁺/Ca²⁺流动速率变化

腐蚀机制和动力学研究

基因组学研究表明，拟南芥有两组基因在受到重力变化刺激后具有高水平表达，一组是重力变化刺激表达基因，一组是对机械物理刺激表达的基因，而且二者有75%以上的共享基因。即：无论是受到重力变化刺激，还是受到机械物理刺激，这75%的基因均表达。本文利用非损伤微测技术双电极同时测量系统，以拟南芥（Arabidopsis ecotypes, Wassilewskija (WS)及以WS为遗传背景获得的突变体Altered Response to Gravity(ARG1)）72小时幼苗为材料，对其在机械物理刺激下的Columella细胞附近区域进行了H⁺和C^a2+流动速率变化的同时检测。详细内容请点击

 

拟南芥根部传导重力变化信号的H⁺和Ca²⁺的偶联运输

H⁺和Ca²⁺被认为在植物重力感知信号传导过程中起重要作用的两种离子[1,2]。但是，截至目前对于究竟是H⁺还是Ca²⁺在这一过程中起主导作用尚存在争议。本文利用非损伤微测技术最新H⁺和Ca²⁺双电极同时测量系统，以及该系统准确、灵活的三维测量方式，以拟南芥（Arabidopsis ecotypes, Wassilewskija (WS)及以WS为遗传背景获得的突变体Altered Response to Gravity(ARG1)）72小时幼苗为材料，对其在重力变化影响下的Columella细胞附近区域进行了H⁺和Ca²⁺浓度变化的同时检测。详细内容请点击

 

动态离子/分子组学与双电极非损伤微测技术

植物离子组学是近些年来植物学研究领域的新方向，它与蛋白质组学、代谢组学和转录组学共同构成认识植物基因组如何真正影响植物表型的概念模型。

双电极非损伤微测技术的出现（图1）,将离子分子测量效率提高了一倍,而且不同电极的自由组合（表1）,可以将不同离子/分子间的变化有机地整合起来,使得动态离子组学能够全面反映真实生理状况,同时也使其结果更加可靠并增加可比性。我们利用该技术对水稻和拟南芥根部H⁺，Ca²⁺, K⁺, Cl^-, Na⁺进行1-2个小时的实时检测，实验发现频率和振幅各异的振荡式吸收或释放。详细内容请点击

 

应用非损伤微测技术测量烟草及百合花粉管外围氢质子活性

本文利用非损伤微测技术对烟草（Nicotiana tabacum）和百合(Lilium longiflorum)花粉管外围不同区域的pH值和氢离子释放或吸收强度进行了研究，测量了花粉管上12个位点的外围pH值和氢离子流的方向和速率。在烟草和百合的花粉管尖端存在明显的氢离子内流，在其相应的外围区域相对于其它区域有碱化的趋势；而接下来的区域则呈现了不同强度的外流，其相应的外围区域的pH值的变化与氢离子的活性变化也基本吻合。详细内容请点击

 

非损伤微测技术在植物活体动态离子组学研究中应用初探

动态离子组学（或称动态/活体离子/分子组学）是试图利用非损伤微测技术获取被测材料在接近正常生理状态下的分子/离子动态信息，并通过这些信息将基因组学、蛋白组学和代谢组学的信息在生理功能水平上加以整合或验证。本文以单子叶植物-水稻(Oryza sativa)和双子叶植物-拟南芥(Arabidopsis thaliana)及其突变体植株为材料，利用单电极或双电极非损伤微测系统对其根部H⁺，Ca²⁺, K⁺, Cl^-, Na⁺动态信息进行了采集。详细内容请点击

 

浮萍富集重金属Cd²⁺的机制探讨

本文利用非损伤微测技术研究了在浮萍(Lemna minor)对重金属Cd²⁺的富集作用中浮萍根及其共生微生物对Cd²⁺的吸收特点，对浮萍富集重金属的机制做了初步探讨。首先，使用配合非损伤微测系统开发的镉离子选择性微电极，对浮萍根部包括共生微生物形成的根鞘吸收Cd²⁺的强度进行扫描性测量，发现根鞘与浮萍根的交界处为吸收Cd2+的最强点；然后，使用酒精处理等对浮萍基本没有损伤的方法将共生微生物杀死，在处理过程中对浮萍根与根鞘的交界处Cd²⁺的吸收进行了实时监测，加入100ppb Cd²⁺后，交界处对Cd²⁺的吸收随着微生物的死亡呈发散型降低。详细内容请点击

 

非损伤微测技术在植物活体动态离子组学研究中应用初探

本文以拟南芥（Arabidopsis ecotypes, Wassilewskija (WS)及以WS为遗传背景获得的突变体Altered Response to Gravity(ARG1)）72小时幼苗为材料，首先研究了Ws和ARG1的根尖形态和生长速率，两者没有发现显著差异。进一步利用非损伤微测技术分别对野生型和突变体的根尖H⁺活性进行研究，在根尖端120微米的区域内每隔10微米测量一点的H⁺活性，野生型外部pH值的由伸长区到根冠逐步升高，ARG1的根尖外部pH值分布趋势相同，但明显碱化，pH值升高了0.13~0.14，初步判定有大量氢离子被吸收入根尖内部。详细内容请点击

 

用非损伤微测技术研究肿瘤细胞的耐药性与其胞外H⁺流变化的相关性

介绍了人乳腺癌细胞（药物敏感株MCF-7/S 及耐药株MCF-7/R）在化疗药物阿霉素（adriamycin，ADR）处理下，细胞外pH 和H+流动方向和速率的变化。为此，建立了一种基于非损伤微测技术（non-invasive micro-test technology，NMT）的药物抗性研究方法（drug resistance study method，DRSM），该方法可用于研究器官/ 组织/细胞外离子/ 分子活性与肿瘤细胞耐药性之间的相互关系。结果显示存在一个持续的并以固有振荡形式出现的胞外H⁺流现象。详细内容请点击

 

非损伤微测技术及其在生物医学研究中的应用

“非损伤微测技术”可使研究人员在被测样品上获得其他技术难以测到的生理特征和生命活动规律，从而在理论研究和应用领域方面产生实质性的突破。“非损伤微测技术”平台还可以方便地与细胞和分子生物学技术、其他电生理技术和显微荧光成像技术配合使用，从而更全面地揭示各种生命现象及其本质。文章较详细地介绍了非损伤微测技术及其在生物医学中的应用，其中包括植物、动物研究领域中与生物医学相关问题研究中的应用以及与其他技术结合的应用等。详细内容请点击

 

 

 

 

其他应用实例—植物学、动物学、医学、微生物学、环境科学、材料科学等

植物学--用NMT发现了质膜上新的Ca²⁺通道GLR

葡萄牙里斯本大学José Feijó教授研究组使用非损伤微测技术研究了氨基酸刺激后花粉管的Ca²⁺流动，发现谷氨酸受体类似基因（GLRs）减少了通过质膜的Ca²⁺内流，进而调节花粉管顶端胞质中的Ca²⁺浓度梯度，最终影响花粉管的生长和形态建成。此外，敲除花粉管丝氨酸消旋酶（SR1的突变体）后GLRs活性下降，导致生长发生缺陷。这些结果直接证实了植物中具有和动物中相似的神经传递系统。文章在在著名杂志《Science》封面以“Research Article”的形式发表。文中提到的“vibrating-probe measurements”是非损伤微测技术的一种。

Michard E, et al. Science, 2011, 332: 434 - 437.

动物学--青鳉尤鱼线粒体富集细胞NH₄⁺的吸收依赖于Na⁺的吸收

中国台湾的科学家使用非损伤微测技术对青鳉幼鱼皮肤表面线粒体富集细胞（MRCs）的H⁺、Na⁺和NH₄⁺的流速进行了测定，发现Na⁺/H⁺交换器（NHE）与Na⁺和NH₃/NH₄⁺的转运相关，提高胞外的NH₄⁺浓度显著抑制NH₃/NH₄⁺的分泌和Na⁺的吸收。相反，提高溶液的酸性可增强细胞对NH₃/NH₄⁺的吸收和Na⁺的分泌。Na⁺的吸收与NH₃/NH₄⁺的外排是通过淡水鱼的MRCs实现，也说明了与斑马鱼通过HRCs细胞对Na⁺的吸收作用机制不同。

WuSC, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2010, 298: C237 - C250.

 

医学

（1）骨骼研究

骨骼作为离子交换的器官

        《Bone》杂志报道了数名科学家使用非损伤微测技术测定生理状态下骨骼的Ca²⁺流，发现Ca²⁺在ECF溶液中出现内流，在无Ca²⁺的ECF溶液中出现外流，这种内外流的转变在整个实验期间都非常稳定。当添加10mM的NaCN时，10min之内Ca²⁺外流消失，说明这种外流具有细胞依赖性。这项研究为我们理解Ca²⁺在骨骼和胞浆中的平衡提供了依据，可以据此为人体补钙。

Marenzanaa M., et al. Bone, 2005, 37: 545 - 554.

 

（2）伤口愈合

电流激活伤口愈合的信号通路

加州大学的赵敏实验室使用非损伤微测技术研究了内生伤口的电流，测定了Na⁺、K⁺和Cl^-电流，发现电信号通过激活特定的酶，可以调控伤口愈合过程中细胞的迁移，并选择性地激活信号通路。

Zhao M, et al. Nature, 2006, 442: 457 -460.

 

微生物学

菌根化过程中的信号转导机制

葡萄牙的Feijó实验室使用非损伤微测技术研究了离子流在菌根生长过程中的作用，发现真菌侵染主要作用于根部伸长区，离子运动及根部酸化发生了剧烈变化，且离子流变化呈现周期性。通过这项研究他们构建模型解释了植物养分吸收和生长加速是通过侵染真菌所介导，依赖于pH的变化，发现Ca²⁺在这一过程中发挥了重要的作用，这为揭开植物和真菌共生互作提供了证据和模型。

Ramos AC, et al. New Phytologist, 2009, 181: 448 - 462.

 

环境科学

鱼胚胎耗氧流速作为环境监测的指标

普渡大学的科学家使用非损伤微测技术检测了鱼胚胎的O₂流，发现在微量有机污染物作用下，鱼类胚胎O₂内流量会显著改变。这是真正意义上的环境污染生物学监测手段，表明污染物的作用可能比原先预计要严重的多。这项技术可用于其他有机生命体，如果将胚胎鱼结合使用于瘤细胞，能够检测到潜在的致癌药物，或帮助发现新的治疗目标。这项研究非常令人欣慰，它能够成为保护人类健康的一项潜在应用工具。该研究采用非损伤微测技术来监测环境毒物的存在，为水质监测提供了新的思路和方法。

Sanchez BC,et al. Environmental Science & Technology, 2008, 42: 7010 – 7017.

 

材料科学

腐蚀机制和动力学研究

葡萄牙的科学家使用非损伤微测技术检测了镁合金在NaCl水溶液中的腐蚀行为，对镁合金的腐蚀机制进行了精确清晰的描述，这项技术为研究金属材料微区域电化学腐蚀过程的机制和动力学提供了一个有力的工具。

Lamaka SV, et al. Electrochemistry Communications, 2008, 10: 259 - 262.

 

 

非损伤微测技术与其他技术的结合

（1）与膜片钳技术的结合

离子通道调节细胞凋亡早期的K⁺外流

墨西哥和澳大利亚的科学家使用非损伤微测技术和膜片钳技术研究了细胞凋亡，发现1μM STS（十字孢碱）会快速引起K⁺外流，同时记录到Kbg通道的电流增加，伴随着膜去极化的急剧下降。Kbg通道调节早期的K⁺外流，Kv1.3通道在后期起到主要作用。这一研究为认识细胞凋亡的内在机制提供了新的证据，这种实时和便于操作的研究手段有望在临床等实际应用领域诊断或检测凋亡细胞。

Valencia-Cruz G, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2009, 297: C1544 - C1553.

 

（2）与荧光/激光共聚焦技术的结合

胞外的Ca²⁺内流参与了胞内Ca²⁺的增加

葡萄牙的Feijó实验室使用激光共聚焦显微镜技术测定了细胞内Ca²⁺的同时结合使用非损伤微测技术测量了进出细胞的Ca²⁺流。细胞融合一旦发生，使用非损伤微测技术测得一个显著的Ca²⁺内流，直接验证了胞外的Ca²⁺的参与了胞内Ca²⁺的升高这一生理过程。

Antoine AF, et al. Nature Cell Biology, 2001, 3: 1120 – 1123.

 

 

 

 

附件二、FAQ

 

1. 非损伤微测技术是一种什么样的技术？

非损伤微测技术是在近似生理条件的液体环境里，通过实时测量离子或分子进出活体材料的动态流速，反映该材料相关基因和蛋白质生理功能的技术。 对活体材料进行实时动态的测定是生命科学的发展趋势，也是科学仪器的发展方向。

非损伤微测技术是实时、动态的测定活体材料的技术，通过测定进出活体材料的离子和小分子的流速这一指标反映生命活动，是生理功能研究的最佳工具之一。

非损伤微测技术与其他活体测定技术有所不同，不受被测材料的限制，能够获得离子和小分子的空间运动大小和方向，具有广阔的应用前景。

 

2.非损伤微测技术测定的指标是什么？

非损伤微测技术测定的是离子和小分子的流速，包括离子和小分子流动程度的大小和流动的方向，具有时间性和空间性的特征，即流速能够反映离子和小分子的流动行为随着时间、空间变化而产生的改变。

非损伤微测技术目前测定已经非常成熟的离子有：Ca²⁺、H⁺、Na⁺、K⁺、Cl^-、NH₄⁺、NO₃^-、Cd²⁺、Mg²⁺；小分子有：O₂、H₂O₂。

更多的离子和小分子的测定在进一步开发中，如IAA、NO、Glucose、Zn²⁺、Fe³⁺等。

非损伤微测技术获得的流速的单位是：10^-12 mol · cm^-2 · s^-1

 

3. 什么是流速（flux）？

3.1 广义的流速

流速是指物质在介质和空间中运动的速度，具有方向性和时间性。

3.2 狭义的流速

流速是指生物体由于内外交换形成的离子和小分子梯度中离子和小分子的运动速度。

注：这里的流速是指生命科学中的流速（flux）。

 

4. 流速的意义是什么？

4.1 流速是活细胞的语言

流速是活细胞信号转导过程的直观反映，是活细胞的语言。

4.2 流速是信号转导/功能的桥梁

流速是基因发挥功能的桥梁，基因表达的指令通过物质的流动进行传递。

4.3 流速是活体生命的本质特征

流速是活体生命的本质特征。

流速概念的引入，推动了生命科学研究从依赖大量前处理实验的传统模式飞跃到简便的活体和动态测量模式，测定流速的工具非损伤微测技术与活体成像技术成为这一模式下最为突出的两项技术。活体测量和活体研究极大地改变了人类对生命活动的认识。

 

注释：

• 实时：快速（以秒为单位）获取、呈现和记录数据
• 动态：长时间、连续不断地测量和获取数据
• 活体材料：具有生命的材料

 

5．应用非损伤微测技术的论文在哪些刊物上发表过？

据不完全统计，非损伤微测技术诞生以来已经在SCI收录的50多种刊物上发表了300多篇论文，以下是一些较有影响力的刊物的名称。

Science、Nature、Nature Protocols、Nature Cell Biology、New Phytologist

PNAS、Plant Cell、Plant Physiology、Plant Journal、Plant, Cell and Environment、Plant Cell and Physiology、Planta、Physiologia Plantarum、Protoplasma、Plant Signaling & Behavior、Plos

Journal of Cell Biology、Journal of Biological Chemistry、Journal of Experimental Botany、Journal of Experimental Biology、Journal of Microbiological Methods、Journal of Biological Engineering、Journal of Neurochemistry、Journal of Neuroscience、Journal of Cell Science、Journal of Physiology、Journal of Membrane Biology

American Journal of Physiology-Cell Physiology、Applied and Environmental Microbiology、Aquatic Toxicology

Biology of Reproduction、BMC Plant Biology、Bone、Biological Bulletin、Biophysical Journal、Biotechnology and Bioengineering、Comparative Biochemistry and Physiology、Diabetes、Development

Eukaryotic Cell、Environmental Science & Technology、FASEB Journal、FEMS Microbiology、Functional Plant Biology

Microbiology、Molecular Neurodegeneration、Molecular Biology of the Cell

Zygote

 

6.从哪里可以购买非损伤微测技术的实验设备——非损伤微测系统？

非损伤微测系统在中国大陆的销售工作由各地经销商负责，目前经销商网络已经覆盖了全国大部分省市自治区。您可以直接联系非损伤微测系统的的本地经销商，如果不清楚谁是经销商请直接联系旭月（北京）科技有限公司（以下简称旭月公司），由旭月公司代为安排。

 

7. 目前有哪些单位购买了非损伤微测系统？

目前国内已经售出十余套非损伤微测系统，包括中国农业科学院下属单位2套、中国科学院烟台海岸带研究所1套、中国林业科学研究院下属单位1套、暨南大学1套、北京林业大学1套、首都师范大学1套、北京市农林科学院下属单位1套及台湾中央研究院下属单位2套。此外，还有超过100位客户以接受测试服务的方式使用非损伤微测系统，这些客户来自北京大学、清华大学、中国农业大学、中国科学院、中国农业科学院、浙江大学、南京农业大学、山东农业大学、山东师范大学、中国人民解放军总医院（301医院）、广州中医药大学、河南大学、厦门大学等全国各地的知名高校和研究机构。

 

8. 非损伤微测系统的售后服务水平如何？

旭月公司拥有一只优秀的售后服务团队，除公司自身经验丰富的技术工程师外，很多国内外知名学者应邀担任了旭月公司的顾问，他们共同为客户提供各种形式的优质售后服务。

旭月公司制定了完善的售后服务流程和规章制度，客户使用非损伤微测系统使用时出现的任何问题联系旭月公司后，旭月公司都会在第一时间提供问题的解决方案。

 

9. 非损伤微测系统能使用多长时间，后续的耗材、试剂贵吗？

非损伤微测系统自身的稳定性极高，使用寿命很长。目前市场在售的非损伤微测系统都是美国原装进口的产品，经过厂家严格检验，质量有保障，完全可以按照国家规定的固定资产最高使用年限估计使用寿命。

非损伤微测系统专用电极

 

相比生命科学领域其他常见仪器，非损伤微测系统后续的耗材、试剂很便宜，完全在可承受的范围内，对此已经购买了非损伤微系统的客户深有体会。

 

10. 如果我暂不购买非损伤微测系统，但希望开展相关的实验，是否有可行的办法？

上文中提到的测试服务非常适合于您。旭月公司设有测试服务中心，只要您设计好实验方案，将实验样品和其他去辅助材料拿到测试服务中心，就可以比较低廉的价格使用中心的非损伤微测系统开展实验。中心配备了专业的技术工程师，无需您亲自操作系统。具体情况请参考旭月公司主页“测试服务”模块或直接咨询旭月公司。

 

11. 非损伤微测系统可测量的对象有哪些？目前测试中心已检测过的样品有哪些？

非损伤微测技术可测量样品的范围较广：整体→器官→组织→细胞层→单细胞→细胞器（富集）。

迄今为止，测试中心测试过的样品种类已超过百种，包括植物类、动物类、微生物类以及非生物类。

植物类：如根、叶片、花粉管、保卫细胞、液泡等。

动物类：如胚胎、胰岛、耳蜗组织、卵细胞等。

微生物类：如丛枝菌根、大肠杆菌、根瘤菌等。

非生物类：如镁合金、陶瓷、碳钢、铝合金等。

 

12. 非损伤微测技术实验涉及到的测试液和校正液是什么？测试液和校正液设计时需要遵循的原则有哪些？

测试液是指测试时样品所处的液体环境。

校正液是指用来校正电极的溶液，原则上尽量和测试液相似。高浓度校正液和低浓度校正液的待测离子浓度范围应该是包含测试液中待测离子的浓度，高低校正液浓度一般相差10倍（一些分子除外）。

注意：测试液中的离子浓度是指溶液所有成分中同一种离子的浓度总和。

 

测试液和校正液设计时需要遵循以下原则：

（1）测试液可尽量和样品的培养液一致，保证样品的活性。

（2）测试液中应该含有所测定的离子（特殊的研究，如先用没有所测定离子的溶液，然后再加入此种离子的实验情况除外）。

（3）测试液中待测离子的浓度不宜过高，尽量维持在一个较低的水平（例如1mM以内）。

（4）测试液尽量维持一定的渗透压和pH值，以保证样品的活性。

（5）不同的校正液之间的浓度一般相差10倍（特殊的分子除外）。

（6）测试液和校正液最好用相应成分的母液（例如：100倍的母液）稀释进行配制，避免直接称量误差较大，导致浓度不准确，影响校正和测试。

（7）测试液和校正液pH的调节需注意，不能用含有待测离子的酸或碱调节，如测定Na⁺时调节pH值不能用NaOH，否则就使溶液中的Na⁺含量增加，可用较少量的KOH调节，最好用氯化胆碱或Tris。

 

13. 非损伤微测技术实验中获取的数据是什么？它们的含义是什么？

通过实例予以说明：下图为非损伤微测系统同时测定植物根K⁺和H⁺的流速时数据采集软件的截图。

图中红色的线代表H⁺，绿色的线代表K⁺，所记录数据为样品离子的流速或者是距样品两点间的电压差ΔV（μV）（纵坐标），横坐标为记录的时间，在零线上方（正值）的曲线是指离子外流（Efflux），零线下方的曲线是指离子内流（Influx），白色点是指进行了一个刺激处理，当受到刺激处理后，H⁺和K⁺的外流增加。

 

14.如果非损伤微测技术实验数据不够理想，一般是什么原因造成的？如何发现问题？

数据不够理想的最可能原因是被测样品的活性状态不佳，其次是配制的测试液存在问题。当然也可能是测试系统本身存在故障，但这种可能性很小，而且很容易及时发现和纠正。

为确认测试中问题产生的原因，可进行人工离子源实验。在相应的测试溶液中进行人工离子源实验，若能观察到正常浓度梯度反应曲线则基本可以排除系统故障的可能性。

注意：样品间某些离子可能存在个体间的差异，因此测试时会出现重复性不好的情况，这种情况需要从样品和测试液本身入手寻求解决的办法。

 

 

展  望

在基因组学、蛋白质组学和代谢组学发展的过程中，越来越多的科学家认识到研究结构和功能的重要性，新的研究中需要新的技术去探索活细胞的生物功能。非损伤微测技术是一种活体研究技术，和流式细胞仪、激光共聚焦等技术成为目前研究活体功能的最佳工具。

非损伤微测技术具有时间和空间上的独特优势，越来越多的研究应用它进行离子和分子流速模式图谱的解析，这种解析可以直观地发现基因和蛋白质的功能。非损伤微测技术所测定的流速是活细胞信号转导过程的直观反映，是活细胞的语言，也是基因发挥功能的桥梁，这种动态的信息也是活体生命的本质特征。流速概念的引入，推动了生命科学研究从传统的大量前处理实验进入简便的活体和动态测量时期，极大地改变了人类对生命活动的认识。

国外的科学家使用非损伤微测技术持续不断地进行着原创性的工作,国内的科学家也如火如荼地使用非 损伤微测技术开展着基因功能的研究,随着美国技术国内组装的实现，该技术一定会得到更加广泛的使用,也必将为推动生命科学的快速发展,进一步提高我国的科研水平做出应有的贡献。

 

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