TOPIC: NMT在昆虫生理研究领域的最新成果

2014年，加拿大约克大学Jean-Paul Paluzzi等人的最新研究成果《The Heterodimeric Glycoprotein Hormone, GPA2/GPB5, Regulates Ion Transport across the Hindgut of the Adult Mosquito, Aedes aegypti》在PLoS ONE上发表，随着这一领域成果的丰富，NMT已逐渐成为昆虫活体器官研究的重要手段之一。


哺乳动物的促甲状腺激素、促黄体激素、促卵泡素均属于糖蛋白激素，而糖蛋白激素特异性受体最重要的组成部分是α亚基（GPA）与β亚基（GPB）。近期，研究者从脊椎动物上鉴定出一个新的糖蛋白激素（Thyrostimulin）。研究显示，它由GPA2与GPB5两个新型的亚基组成，且与节肢动物、线虫、棘细胞上的这一亚基同源。Paluzzi等使用基因手段研究GPA2/GPB5在登革热病毒的宿主--埃及伊蚊上的表达情况，并利用非损伤微测技术（NMT）观察了GPA2/GPB5对伊蚊消化系统Na⁺/K⁺平衡的调节作用。


前期研究显示，Thyrostimulin的受体AedaeLGR1在伊蚊消化道的中肠、马氏管以及后肠有表达，尤其在后肠部位表达较高。此外还发现，GAP2/GPB5具有调节上皮组织阳离子转运的能力--抑制Na⁺外排、促进K⁺外排。实验以后肠部分的回肠、结肠作为研究位点，利用NMT检测了对照组以及200 nM GAP2/GPB5处理后Na⁺、K⁺的流速变化。结果显示，GAP2/GPB5处理后，较对照组，回肠Na⁺外排明显减弱，结肠未有明显变化。回肠及前结肠K+吸收较对照组分别减弱68%、79%，后结肠也呈现下降趋势。


上述研究结果表明，AedaeGAP2/GPB5可用于调节如雌蚊消化、吸收血红细胞过程中低Na⁺高K⁺这一生理现象，并取得了生理功能上的直接证据。NMT在国内已经深入作物研究的各个领域，而这一研究成果对于植物保护（作物害虫）领域如何应用NMT进行活体功能研究具有启发意义。

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一些昆虫以表皮突起作为主动吸收离子的部位。例如蚊幼虫、蜉蝣稚虫的肛乳突（anal papillae），其大小和离子吸收与环境中盐分的含量相关，在含盐量越少的环境中，其肛乳突越发达。生活在咸水或半咸水中的昆虫其调节盐度的范围较宽。


为了揭开低盐环境中摇蚊幼虫对离子的吸收机制，加拿大的科学家Donini教授等人研究了摇蚊幼虫肛乳突在低盐条件下的离子调控作用。使用非损伤微测技术测定了摇蚊暴露在低盐的水中（IPW）通过肛乳突的离子种类、方向和流速。在淡水（FW）和IPW条件下肛乳突不同位置NaCl的吸收和H⁺的分泌可能主要归功于K⁺的交换。在IPW中严重和长期的暴露增加了通过肛乳突的Na⁺、Cl^-和H⁺的转运，但是在这两个条件下的增加机制不同。严重的IPW暴露增加了肛乳突不同位置的离子流速。长期的IPW暴露导致增加了肛乳突的大小，但是没有引起离子流速的改变。Na⁺/H⁺交换体的抑制剂EIPA和碳酸酐酶的抑制剂醋甲唑胺（methazolamide）提供了肛乳突Na⁺/H⁺和Cl^-/HCO₃^-交换机制的证据。


这个研究证明了摇蚊幼虫应用两个不同的机制增加离子的转运，调节血淋巴中离子的活性。这两种机制是摇蚊适应低盐环境的重要特征。这个研究为动物、植物适应不同的低盐环境提供了基础和借鉴，也为我们认识摇蚊幼虫为何能够在多种环境下生存提供了证据。

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昆虫和甲壳动物有很好的血脑屏障来保护神经免受毒物的伤害。以前研究血脑屏障离子流速使用同位素示踪法，但是无法提供空间方面的信息。


在这项研究中，加拿大的科学家使用非损伤微测技术直接测定了不同部位、不同时间和不同处理下的K⁺流速，从空间和时间两方面获得了离子流的信息。使用非损伤微测技术测定了通过蟑螂血脑屏障的K⁺流速，在含有15mM或者25mMK⁺的盐溶液中，神经节K⁺外流，这和通过神经节连接处的K⁺内流所平衡。CN-代谢抑制引起神经节和连接处的K⁺外流增加，在无K⁺的盐溶液中冷却神经节可以降低K⁺流速。暴露在抗生素两性霉素B中神经节和连接处的K⁺剧烈外流。3M的尿素引起了通过腹神经索细胞旁的K⁺的渗漏。K⁺通道抑制剂Ba²⁺抑制了K⁺外流，四乙胺、或者暴露在无Ca²⁺和溶液中引起K⁺外流减小，乌本苷引起K⁺外流增加。


这项工作通过对昆虫蟑螂的研究，发现药物以及K⁺通道抑制剂对K⁺的影响有差异，结构差异例如更高的线粒体密度，这种差异可能决定了K⁺外流或者内流的模式。因此，我们通过非损伤微测技术进行离子流在空间中的变化模式，从而说明某些结构的重要功能。

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蚊子是许多哺乳动物病原的宿主，包括寄生虫、细菌、病毒和真菌。疟疾主要是通过按蚊传播的疾病。为了控制疾病，了解传播的过程非常重要，因此需要研究蚊子幼虫的环境适应性。蚊子幼虫能够适应多变环境是因为蚊子的直肠有一个高度发育的离子调控系统。直肠负责吸收离子和营养，排出过量的盐和废弃物。但是这种调节的过程一直不清楚。


2010年，美国佛罗里达大学和MBL的科学家Smith等人使用非损伤微测技术等方法研究了按蚊的离子调控机制，发现直肠中的两类细胞对离子转运和蛋白表达有显著的差异。


离子调控是蚊子幼虫生存的重要生物学过程，由直肠负责调控。这篇文章研究了按蚊直肠的两类细胞DAR（背部前突直肠）和Non-DAR（非背部前突直肠）细胞。在2%和50%的人工海水中用非损伤微测技术测定了质子流速，发现两种类型的细胞基础质子流速不同，且药物抑制剂处理后质子流速也不同，说明蛋白功能在两种环境中有差异。组织学分析表明Non-DAR细胞的结构适合调节离子转运。根据这个研究结果建立了直肠离子调控的模型，即Non-DAR细胞在淡水中再吸收离子，在海水中分泌离子的功能。这样，按蚊幼虫可以适应各种盐环境。这项工作测定了不同环境中蚊子的离子流速，对认识生物的环境适应性提供了思路。

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大部分水栖型昆虫在短时间内对镉（Cd²⁺）不敏感，而摇蚊幼虫的LC50数值超过了美国环境保护局物种敏感分布法公布的最大浓度标准的25,000倍。鉴于此现象，加拿大的研究人员以摇蚊幼虫的肠和马尔皮基管为材料，对Cd²⁺进出组织的流动速率、镉分泌物以及镉螯合物进行了研究，分析其中的机理。


在该研究中，将摇蚊幼虫浸泡在10μmol/L的Cd²⁺溶液中，发现马尔皮基管可以在15h之内分泌完全血淋巴负担的Cd²⁺。采用非损伤微测技术（SIET）沿摇蚊幼虫的肠腔进行检测，发现肠并不完全是Cd²⁺进入血淋巴的屏障。Cd²⁺进入血淋巴的关键位点在中肠前端，而中肠后端Cd²⁺的来源是肠腔，血淋巴吸收和组织中的镉螯合相并存。该研究的结果强调了肠和马尔皮基管在摇蚊幼虫转运和吸收毒性重金属镉的过程中发挥了重要的作用。


这个研究首次将镉离子选择电极和非损伤微测技术应用于动物镉的检测，也是首次在生理学意义上直接检测重金属镉在动物细胞和组织层面的转运机理。非损伤微测技术为我们精确描述了Cd²⁺转运的平衡机制，准确识别了Cd²⁺的转运位点，实时获得了Cd²⁺流进、流出生物样品的速率，为组织转运Cd²⁺的机制提供了最直接的证据，同时也为这类问题的研究提供了新的思路与模式。

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蚊子幼虫生活在多样且多变的环境中，从淡水到海水中都有广泛分布，为了适应这种差别极大的环境，蚊子幼虫必须要快速改变自身的系统来适应环境。蚊子幼虫的生存依赖于它们在多变的环境下调节离子内流和外流的能力。


加拿大的科学家把蚊子幼虫从淡水转移到30%的海水中，或者从30%的海水转移到淡水中，使用“非损伤微测技术（SIET）”测定了血淋巴离子浓度随时间的变化过程，首次获得了Na⁺和Cl^-转运的动力学，发现Na⁺和Cl^-的吸收相互独立，在高盐环境下Na⁺和Cl^-吸收减少，Na⁺和Cl^-吸收的转变可能是血淋巴离子水平改变的结果，离子转运的快速改变影响了乳突形态和超微结构的长期改变。


本文揭示了乳突中离子转运动力学的快速变化和淋巴中离子浓度的变化完全一致。

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卵子发生在生物体形成过程中非常重要，影响到胚胎的发育以及个体的形成，在这个过程中，H⁺动力学起到一个关键的调节作用，细胞通过H⁺转运维持膜电势和产生跨膜的化学梯度来驱动次级代谢，但是在昆虫滋养型卵母细胞成卵过程中发生的H⁺流的变化和H⁺流引起的pH值变化所起到的调节作用却了解很少。利用“非损伤微测技术”可实现对H⁺流在不同时间和空间的实时监测，从而揭示H⁺流在昆虫滋养型卵母细胞生成过程中所起到的调节作用。


美国Wadsworth中心神经系统失调研究实验室科学家Bjornsson C. S.等采用“非损伤微测技术”对红锥蝽（Rhodnius prolixus）在相同生长部位的不同生长阶段进行胞外H⁺流实时监测发现，卵黄生成中期卵巢管中分离相邻卵泡囊的主茎表现出显著的H⁺外流，而在卵黄生成后期H⁺外流减弱。H⁺外流的现象不仅在主茎生成之前已经产生，而且先于邻近卵泡囊的卵黄生成起始阶段。另外在生成绒毛膜的末端卵泡囊和卵泡囊排卵后也分别检测到了H⁺的外流现象，这揭示了躯体的卵泡上皮细胞控制着H⁺的外流。


该研究通过非损伤微测技术检测昆虫成卵过程中H⁺流的变化，揭示了H⁺流在卵黄生成的起始阶段、内吞、卵泡细胞骨架动力学及滤泡反馈机制调节中的重要作用，跨膜H⁺流可促使胞内pH值的改变。这为昆虫成卵过程的机理研究提供了新颖的思路和方法。

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本文的作者之一，来自McMaster University的昆虫学家Michael J. O’Donnell，利用非损伤微测技术，在昆虫研究领域已发表了数十篇SCI文章，编号如下，有需要的研究人员可以登录下载：

1. 已收录进NISC文献库，可通过登录下载
F2012-008
F2009-020
F2005-011

2. 暂未收录进NISC文献库，可点击前往官网下载
1）Effects of diuretic hormone 31,drosokinin,and allatostatin a on transepithelial K+ Transport and contraction frequencty in the midgut and hindgut of larval

2）Ion-selective microelectrode measurements of Tl+ and K+ transport by the gut and associated epithelia in Chironomus riparius

3）Ammonium secretion by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of a novel ammonium-selective microelectrode

4）Phenotypic plasticity in response to dietary salt stress: Na+ and K+ transport by the gut of Drosophila melanogaster larvae

5）Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus

6）Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl– cotransport and Cl– conductance

7）Analysis of epithelial transport by measurement of K+, Cl- and pH gradients in extracellular unstirred layers: ion secretion and reabsorption by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus