主题： 是否有测试液泡的文献可供参考

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中科院植物所陈显扬博士的毕业论文《盐角草SeLCY和SeNHX1基因功能研究》里，利用NMT检测了烟草叶片液泡，而且在正文中也给出了烟草叶片液泡的提取方法。文字最下方有原文PDF。

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3.2.2原生质体和液泡的分离

lg的烟草叶片材料被裁剪成小块(2mm× 2mm)，然后浸泡在含有1.5%(w/v)的离析酶，2% (w/v)的纤维素酶，0.5M甘露醇和25mM Mes- KOH ( PH=5.7 )的溶液中，在28℃ 的温度下轻摇6 - 8小时(40rpm)。原生质体通过一层纱布过滤，4°C离心100× g l分钟。丢弃上清，保存沉淀。

为了释放出液泡，沉淀悬浮于0.2M甘露醇和25mm Tris-HCl（PH7.5)溶液中，并每隔2分钟用枪吸打5次，一共进行10分钟。悬浮液铺设至8% (w/v) 内)Ficoll40O溶液(25mm Tris- HCl，0.5M甘露醇，pH=7.2)的顶层。平转头，4°C，2000×g离心20分钟。取上层液面，用显微镜观察液泡(图3.1)。



对照组-传统超速离心法(记作方法M2)，此方法为现有技术。

l、制备原生质体
方法与实验一中所述一致。

2、裂解原生质体
将步骤1得到的沉淀加入原生质体裂解缓冲液中，轻轻吸打10分钟，得到悬浮液；
l升原生质体裂解缓冲液的配制方法: 将36.43 g甘露醇和3g Tris加入1L水，混匀，并用HCl调节pH值至7.5。

3、分离纯化液泡
将步骤2得到的悬浮液加入铺设4层Ficoll-400溶液(25mM Tris- HCl,，0.5M甘露醇，pH7.5)的顶层。其中，四层不连续梯度的Ficoll-400浓度从上至下分别为1.5，7，12.5和20%(质量百分含量)。利用BECKNIAN Optima L- 80XP超速离心机，使用平转子进行90,000g离心2h，4℃ 。完整的液泡带在1.5%和7% Ficoll-400梯度界面之间，用枪吸取1.5%和7% Ficoll-400梯度界面之间的溶液，即得到液泡提取液。

将上述三组实验获得的液泡，分别通过Zeiss IM-35倒置相差显微镜进行观测，统计通过显微镜镜头能清楚辨认的液泡数量。对于每种提取方法提取的液泡，均取100ul的液泡提取液，进行检测，然后统计其中的液泡数量。将相对于M1方法提取所得液泡数量的倍数设定为液泡提取效率。液泡提取效率=不同方法提取所得液泡数量/Ml方法提取所得液泡数量。

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《盐角草SeLCY和SeNHX1基因功能研究》液泡提取源文件

您好，NISC文献库中收录了几篇测定液泡的文献，编号分别为：C2015-009、C2014-006、C2011-007，您只需在NISC文献库搜索界面中输入这些文献编号，便可下载下来进行阅览。

您提到的液泡提取方法，文献中有这样的一段描述：
1) 取材料下胚轴及子叶剪碎或搅拌机搅碎取一毫升酶解液酶解2小时左右23℃ 60 rpm。
2) 用bath稀释酶解液终止反应，过滤酶解液得到原生质体。80 g离心5 min，bath清洗细胞，弃上清，留500 ul 细胞液。
3) 取等量原生质体溶液与裂解液混合静置两分钟后镜检。
4) 用液泡bath（测试液）清洗液泡，静置固定10 min。用新鲜的测试液冲洗，去杂。

不过最终适合您材料的提取方法，还需要根据您的实验材料而定。在此建议您，测试之前先在学校的实验室多尝试一下提取液泡的方法，并观察提取效果，从而保证最终实验的顺利进行。