主题： NMT在活体细胞研究上的应用--医学生理学

心肌细胞

文献编号：F2001-001（香螺心室肌）

肝细胞

文献编号：C2012-008；C2009-001

神经元

文献编号：F2010-017

AD（阿尔茨海默症，老年痴呆症）是一个进行性发展的退行性疾病，主要特征是形成不溶的淀粉样病斑和神经纤维缠结。β-淀粉体(Aβ)是Aβ病斑的主要组分。神经元暴露在慢性、亚致死剂量的Aβ中超过一定的时间可能会致病，然而许多研究没在在活细胞中进行研究，因此存在一些问题。

为了研究AD发病的机理和解决活细胞测定的问题，澳大利亚的科学家使用非损伤微测技术研究了活体神经元的K+和Ca2+流速。发现初级皮层神经元在1μM的Aβ1-40中超过7天，神经元存活率下降了20%，这种细胞的存活率和K+外流的增加有关。另外，10μM的Glu诱导了神经元的兴奋性中毒，1μM的Aβ处理1天后用Glu再处理导致了更大的K+外流，K+外流在Aβ处理20min后更高，用Glu处理导致K+外流增加了2.8倍。Ca2+的吸收用Aβ处理20min就增加了2.5倍。研究结果认为神经元长期暴露在Aβ中会致病，因为Aβ降低了皮层神经元维持K+和Ca2+平衡对Glu的反应，这种反应可能是AD早期症状发生的原因。

这项研究发现神经元失去维持K+和Ca2+平衡的能力可能是细胞对Aβ早期反应的指示。在将来的工作中我们可以通过K+流检验微量的Aβ（1μM），K+外流指示AD的早期症状以及Glu与Aβ的协同作用。




神经胶质瘤细胞

文献编号：C2014-002

神经胶质瘤是一种高发病率与死亡率的常见原发性脑瘤，体内外研究表明，光动力疗法（PDT）可以使神经胶质瘤细胞发生死亡。近期的研究显示，PDT抑制神经胶质瘤与C6神经胶质瘤细胞外谷氨酸浓度上升以及作为Ca²⁺与K⁺通道的谷氨酸受体AMPA表达的上调有关，但PDT如何影响细胞内外的Ca²⁺与K⁺的跨膜流动还未进行过研究。

该报道以C6神经胶质细胞瘤为研究对象，通过非损伤微测技术发现，正常状态下C6神经胶质瘤细胞Ca2+少量外流，K+内流，当进行PDT干预后，发生明显的Ca²⁺内流和K⁺外流，细胞发生死亡。谷氨酸受体AMPA的拮抗剂CNQX可以抑制PDT干预后Ca²⁺与K⁺流的改变。

这项研究更进一步的揭示了PDT引起神经胶质瘤细胞死亡的分子机制，显示出癌细胞的死亡可能与Ca²⁺内流和K+外流这个转变的发生有关。








神经元

文献编号：F2011-005（Nature Cell Biology）



B细胞淋巴2（Bcl2）家族蛋白调节程序性细胞死亡，但是抗细胞程序性死亡蛋白如Bcl2和Bcl-xL如何阻止细胞死亡的过程还不了解。Bcl-x_L促进线粒体和胞质之间代谢物的交换，也是成年大脑中主要的抗细胞程序性死亡的蛋白，Bcl-xL过表达增加了突触的数量和大小。

为了研究Bcl-x_L的调节作用，耶鲁大学的科学家使用非损伤微测技术在“Nature Cell Biology”发表文章，发现过表达Bcl-x_L的神经元有更高的ATP水平，外源Bcl-x_L减少或者抑制ATP。尽管ATP水平增加，但是过表达神经元Bcl-x_L的耗氧降低，且Bcl-x_L消失后增加了氧气吸收的水平。证据表明Bcl-x_L与F1F0 ATP合成酶的β-subunit直接作用，减少了F1F0 ATP成酶复合体中的离子渗漏，因而增加了F1F0 ATP活动期间通过F1F0的H⁺转运。此外，重组Bcl-x_L蛋白直接增加了纯化的合成酶复合体ATPase活性的水平，并且外源的Bcl-x_L减少了F1F0酶活性的水平。发现表明在Bcl-x_L表达的神经元中增加线粒体的效率归功于增加了突触的效能。

本研究认为Bcl-x_L通过减少质子从F1F0 ATP酶的渗漏增加ATP合成酶的效率，因此促进了神经元的代谢。这里通过非损伤微测技术直接测定神经元的氧气流速，从而准确地认识了Bcl-x_L所引起的线粒体代谢效率的增加，为更多的代谢方面的研究提供了新手段。




肿瘤细胞

文献编号：C2012-026

单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotubes, SWCNTs），具有优异的电子、机械、力学等性能，尤其对电子具有超高的迁移率，是最具潜力的新型器件材料。在生物医药领域，因其特有的生化性能，广泛用于药物传递、体内成像等。本研究观察了SWCNTs进入细胞后对线粒体功能的影响并为SWCNTs在生物医药的应用提供了理论基础。

本文以口腔表皮样癌细胞作为研究材料，经SWCNTs处理后，线粒体膜电位以及胞内Cyt C含量降低、活性氧水平升高。此外还发现，SWCNTs扰乱了Cyt C的电子传递。为了观察SWCNTs是否影响线粒体呼吸作用，采用非损伤微测技术（NMT）检测了细胞O₂流速。结果显示，SWCNTs处理后，细胞的O2吸收速率较对照组下降，24h处理组的O₂吸收速率仅为对照组的9.7%，O₂吸收速率与处理时间成反比。

研究结果表明，SWCNTs抑制了线粒体的呼吸作用，使得细胞的代谢水平降低。产生这一变化的原因是Cyt C的电子传递受抑制导致其氧化还原活性下降。非损伤微测技术通过检测细胞整体的O₂流速，间接地反映出线粒体呼吸作用的强弱，为本研究提供了代谢水平上的直接证据。








神经元

文献编号：F2005-020（神经毒性）





肿瘤细胞

文献编号：C2012-018（鼻咽癌细胞）

低渗环境下，细胞发生肿胀，在调节性细胞容积缩小（RVD）的作用下，细胞体积恢复正常。传统理论认为这一过程中，K⁺、Cl^-协同外排，同时带走胞内水分，使细胞恢复正常体积，这个理论也是膜片钳实验的结论。在采用非损伤微测系统分别检测K⁺与Cl^-流速后发现，K⁺外流只参与了RVD最开始的一段过程，随着胞内H⁺外流至细胞外表面导致K⁺通道关闭后，H⁺的外流代替了K⁺的外流，证明了在RVD过程中，K⁺与Cl^-的外排是相对独立的。之所以膜片钳研究的时候出现了K⁺通道一直开放的情况，是因为检测时胞内外的溶液混合到一起，胞外H⁺浓度无法发生有效改变，K⁺通道便一直开启。

随后，又运用非损伤微测技术对细胞迁移的过程进行了研究，发现迁移过程中，细胞前部K⁺内流，后部K⁺外流，此时，Ca²⁺浓度在迁移的细胞内呈前低后高的趋势，并由此推测迁移细胞后部Ca²⁺内流后激活Ca²⁺依赖的K⁺通道，导致K⁺外流，启动RVD，而迁移细胞前部恰恰相反，从而实现了细胞迁移。