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主题: 非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流

非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流 2017-09-17 15:01 #2541

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非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流(文献编号:H2017-001


摘要:
脑内 β-淀粉样蛋白(amyloid-β protein, Aβ)的聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 的重要病理特征。Aβ 的神经毒性作用机制与其扰乱神经元 Ca2+稳态有密切关系。非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique, NMT)是近年发展起来的一种利用 Fick 第一扩散定律和 Nernst 方程,通过非接触方式检测膜外扩散电位获取离子跨膜流速的最新技术手段。本研究在 C57BL/6 小鼠海马脑片,利用 NMT 首次检测了 Aβ 对谷氨酸(Glu)诱发的 Ca2+内流以及细胞外低钙引起的 Ca2+外排的影响,并初步探讨了 Aβ 扰乱神经元 Ca2+稳态的相关机制。

结果显示:(1)急性给予 Glu 可诱发海马脑片 CA1 区神经元产生起始快、继而缓慢衰减的持续性内向 Ca2+流;(2) Aβ 预处理浓度依赖性地增强海马神经元对 Glu的反应性,显著提高给药后 5 min 内 Ca2+内流的平均流速,而 NMDA 受体拮抗剂 D-APV 可有效阻断 Aβ 对神经元 Glu 反应的这种易化作用;(3)用低钙人工脑脊液急性灌流脑片可引起海马 CA1 区神经元产生持续的外向跨膜 Ca2+流,其大部分可被特异性 Na+/Ca2+交换体抑制剂 KB-R7943 所阻断;(4) Aβ 预处理可部分抑制低钙人工脑脊液引起的 Ca2+外排。

这些结果表明:Aβ 引起的细胞内 Ca2+超载不仅涉及到 Ca2+内流增加,也与其对 Ca2+外排的抑制有关;Aβ 易化 Glu 的兴奋毒作用主要是通过NMDA受体介导的,其抑制Ca2+外排的靶点主要是Na+/Ca2+交换体。NMT 具有操作相对简单、实时获取结果、非损伤的优点,适用于脑片Ca2+内流和 Ca2+外排的长时间测定。

因此,本研究不仅为解释 Aβ 所致 Ca2+超载的神经毒性机制提供了新的实验证据,也为开展跨膜 Ca2+信号转导机制的脑研究提供了新的技术方法。



关键词:
关键词:非损伤微测技术;海马脑片;Ca2+流;淀粉样β蛋白;谷氨酸




















讨论:

Ca2+是细胞内重要的第二信使,钙信号转导对于维持神经元的正常功能起着重要的调节作用。安静情况下,神经元胞浆内游离 Ca2+的浓度很低,这使得细胞在受到刺激时能够通过外钙内流和(或)内钙释放显著改变细胞自身的功能活动。Glu 是哺乳类动物中枢神经系统中广泛存在的兴奋性神经递质。在大脑皮层和海马锥体神经元中,它通过与 Glu 受体的结合在学习记忆中发挥重要作用。Glu受体中的 NMDA 受体属于促离子型受体,是存在于质膜上的阳离子通道,对 Ca2+有较大的通透性。当细胞去极化到一定程度时,结合了配体 Glu 的 NMDA 受体通道可打开,从而介导 Ca2+内流,成为神经细胞主要的 Ca2+内流途径之一。脑内 Glu 的水平以及 Glu 受体的功能是否正常,对神经元的兴奋性以及各种脑功能的完成都具有重要作用。然而,胞内 Ca2+水平是一把双刃剑,当细胞外 Glu 浓度过高或 Glu 受体功能发生异常上调时,经由 Glu 受体通道大量流入的 Ca2+可使细胞内出现 Ca2+超载,继而激活某些磷脂酶、蛋白酶、内切酶、一氧化氮合酶等,由此损害了细胞功能,最终使神经元出现凋亡或死亡。



AD 时脑内发生的神经元退行性改变和学习记忆功能下降,可能就与 Aβ 所致的钙稳态失调特别是 Ca2+ 超载有关。有研究表明,正常生理浓度(pmol/L~nmol/L)的 Aβ 在脑内有益于神经生长,可促成长时程增强(long-term potention, LTP)的形成并参与神经递质的调节。但较高浓度(μmol/L)时会出现神经毒性作用,对已分化、成熟的神经元产生显著的伤害作用,并抑制神经递质的释放,引起神经元变性和坏死。Mattson 等发现,Aβ 能促进胞外 Ca2+内流,升高神经元胞浆内的 Ca2+水平,使神经元对 Glu 的神经毒性更加敏感。还有研究表明,可溶性寡聚体 Aβ 可易化 Glu 的兴奋毒作用,影响突触传递,损伤海马 LTP。本研究组前期采用细胞内钙成像的研究也表明,急性给予 Aβ1-40、Aβ25-35 或 Aβ31-35 均可剂量依赖性增加大鼠原代培养神经元的细胞内 Ca2+浓度。本研究采用 NMT 手段探测了急性给予 Glu 或 Aβ 对小鼠海马脑片跨膜 Ca2+流的影响,结果显示:Glu 可在海马脑片神经元浓度依赖性地诱发内向 Ca2+流(图2),这与 Shabala 等在原代培养的皮层神经元上的结果以及我们先前在细胞Ca2+成像实验中观察到的胞内 Ca2+水平升高是基本一致的。我们注意到,这种Glu 诱发的 Ca2+净内流流速不是恒定的,给药后 5 min 内 Ca2+流速从起始的最大值有一个逐渐减小并趋于平稳的过程,这可能反映了细胞为抵御持续 Ca2+内流、恢复 Ca2+稳态所启动的 Ca2+主动外排机制。重要的是,本研究观察到,急性给予 Aβ 可诱导出明显的内向 Ca2+流(图 2),且 Aβ 引起的 Ca2+内流程度与给予的 Aβ浓度具有很好的相关性。这一结果,为以往实验包括我们在内曾观察到的 Aβ引起细胞内 Ca2+超载的现象,提供了直接的 Ca2+跨膜流动(包括方向和速率变化)变化新证据。以往研究证实,Aβ 能通过易化 Glu 受体增加 Ca2+内流。本研究也显示,在 Aβ 预处理后的海马脑片上,Glu 诱导的内向 Ca2+流速要比未经 Aβ处理的脑片大得多(图 3)。这说明,Aβ 预处理对 Glu 受体具有明显的易化作用。进一步的问题是,Aβ 对哪一种促离子型 Glu 受体的易化作用更强?本研究比较了联合给予 Aβ 和 NMDA 受体阻断剂 D-APV 或 AMPA 受体阻断剂 CNQX 的差异,结果显示:D-APV 对 Ca2+内流压抑效应较 CNQX 更明显。这提示,NMDA受体可能在 Aβ 对 Glu 受体的易化作用中贡献更大。



胞内钙稳态的调节机制涉及质膜 Ca2+转运调节和胞内 Ca2+库调节。本研究采用的 NMT 技术将 Ca2+敏感电极直接置于非常靠近细胞(约 50 μm)的膜外一侧,主要记录并反映的是跨质膜的 Ca2+净移动情况。细胞维持胞内 Ca2+稳态和正常的兴奋性离不开质膜对 Ca2+的主动转运,即 Ca2+外排。在可兴奋细胞如神经细胞中,Ca2+的外排主要通过 NCX 和 PMCA 两种主动转运机制得以实现。NCX存在于细胞的膜性结构上,以心、脑和肾分布最多。NCX 在脑内的表达有多种亚型,通过调节神经元 Ca2+浓度参与神经递质的释放、突触可塑性及胶质细胞的发育等过程。有研究表明,敲除海马区的 NCX3 可损害小鼠的 LTP。PMCA在脑组织中的表达量也相当高,其对 Ca2+亲合力高,但容量小,主要负责 Ca2+转运的精细调控。本研究利用 NMT 技术和急性给予低钙液灌流,在海马脑片上记录到了外向跨膜 Ca2+流,这种 Ca2+外流并非起因于离子电极尖端所处溶液中的 Ca2+浓度变化,因为远离脑片或在无脑片的 aCFS 中,给予低钙液灌流并未检测到任何明显的 Ca2+流速变化(结果未显示)。本研究显示,这种低钙液诱发的Ca2+外流可以被 PMCA 抑制剂 TFH 和 NCX 抑制剂 KB-R7943 所阻断。其中KB-R7943 的抑制作用更加明显,几乎将低钙诱发的 Ca2 外流流速抑制到原先的10% (图 5)。这提示,低钙液诱发的海马 CA1 区神经元 Ca2+外流可能主要是 NCX活动增加所致。那么,Aβ 是否在增强 Glu 兴奋毒、提高 Ca2+内流的同时也能影响 Ca2+外排机制?本研究结果显示,Aβ 预处理可使低钙液诱发的海马神经元外向 Ca2+流速明显降低。鉴于 NCX 在海马神经元 Ca2+外排中所做的突出贡献,我们推测,Aβ 极有可能影响到 NCX 的功能,进而抑制了正常的 Ca2+外排。然而,本研究尚不能排除 Aβ 对 PMCA 的伤害,因为 TFH 也能部分抑制低钙液诱发的Ca2+外流。Aβ 抑制 Ca2+外排的确切机制还有待结合其他方法如分子生物学手段进一步明确,但 Aβ 抑制 Ca2+外排、加速细胞 Ca2+超载的病理意义已是显而易见的。



与现有的离子测定技术比较,NMT 的最大特点在于记录电极不接触组织,对细胞不构成任何损伤,故可长时间用于 Ca2+跨膜净流速的实时动态测量。同时,通过改变记录电极尖端的口径和适当调整电极与标本的距离,NMT 技术可在一定程度上提高空间分辨率,达到既可检测单细胞,也可同时检测多细胞的跨膜Ca2+流。本研究采用的是单电极 Ca2+测定技术,电极尖端口径约 5 μm,距离海马 CA1 区细胞层上方约 50 μm,故测得的 Ca2+浓度变化反映的是多神经元在该处的同步化活动。值得一提的是,NMT 技术还可以使用多电极记录,并且不限于 Ca2+流,这就为脑片上不同脑区的各种离子同步化检测提供了极大的便利。当然,由于检测原理和技术所限,NMT 的时间分辨率较低(远不如电压钳技术),也不能直接测定胞内各种细胞器的 Ca2+信号变化。因此,根据实验需求,选择最恰当的一种或多种方法,取各实验手段之长进行综合研究可能是更有意义的。



总之,本研究采用 NMT 技术,通过 Glu 诱发 Ca2+内流和低钙液引起 Ca2+外排,探讨了 Aβ 对海马脑片 CA1 区神经元跨膜 Ca2+流的影响,证实了 Aβ 不仅可以引发基础状态下的 Ca2+内流、易化 Glu 对神经元的兴奋性,也能抑制 Ca2+外排,从而加速神经元钙稳态的失衡,导致细胞 Ca2+超载。因此,本研究为探讨Aβ 神经毒性作用机制的 Ca2+超载学说提供了又一新的实验证据;同时,本实验在检测脑片组织跨膜 Ca2+流中显示出的快速、方便和非损伤特征,特别是低 Ca2+液可靠诱发 Ca2+外排的结果也为开展脑功能 Ca2+信号转导机制的研究提供了新的技术思路。
最后修改: 2017-09-17 15:03 由 Magee.
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