OSense O-Sense

 

旭月NMT简报---关键词搜索:

山西医大祁金顺:NMT发现谷氨酸和Aβ诱导神经元Ca2+内流可被NMDA受体阻断剂逆转 为了解AD相关疾病的发生机制提供依据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

基本信息

主题:NMT发现谷氨酸和Aβ诱导神经元Ca2+内流可被NMDA受体阻断剂逆转 为了解AD相关疾病的发生机制提供依据

标题:GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂改善3xTg-AD小鼠学习记忆功能的电生理和分子机制研究

论文类型:山西医科大学硕士学位论文

者:山西医科大学祁金顺、李甜

 

检测离子/分子指标

Ca2+

 

检测样品

8月龄雄性C57BL/6小鼠脑片

 

中文摘要(谷歌机翻)

      AD的一个重要病理特征是脑内聚集有大量、高密度的淀粉样β蛋白(amyloid-βprotein, Aβ)。内源性Aβ的主要分子形式是Aβ1-40和Aβ1-42,两者均为β-分泌酶和γ-分泌酶作用于单链跨膜的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)后的产物。研究表明,Aβ发挥神经毒性作用的活性中心位于25-35序列(Aβ25-35)甚或 31-35 序列(Aβ31-35)。实验室早期的研究曾发现,Aβ31-35预处理可使小鼠培养的大脑皮层细胞凋亡、可抑制大鼠大电导钙激活钾通道的功能活性、还能损伤大鼠在体海马的突触可塑性和空间学习记忆能力。已经明确,作为细胞内第二信使,Ca2+在多种生命活动中扮演着重要的信号转导作用。同时,神经元细胞内发生的Ca2+超载又成为Aβ产生细胞毒性作用的一个离子机制。因此,快速、准确检测神经元跨膜Ca2+流的动态变化,不仅可以帮助了解细胞维持Ca2+稳态和正常功能活动的原理,也有助于揭示AD以及其他与Ca2+信号扰乱相关疾病的发生机制。目前,测定神经元跨膜Ca2+流的技术手段主要有:细胞内离子成像和电生理记录膜电流。然而,受技术所限,这些方法均有不尽人意之处。细胞内Ca2+成像往往局限于培养细胞水平,而且需要将Ca2+敏感的染料(如Fura-2和Fluo-4等)导入到细胞内,但染料本身可以影响细胞活性,还随时间延长和激发光持续作用出现淬灭。电生理技术可以直接测定跨膜Ca2+电流,但电极经封接、破膜进入细胞的过程已对细胞构成伤害,也很难进行长时间记录,且空间分辨率低、实验操作复杂。非损伤微测技术(NMT)是近年发展起来的一种以非接触方式直接 获取离子跨膜内流或外流流速的最新技术手段,其根据Fick第一扩散定律和Nernst方程,通过检测细胞外两点间电位差的改变,从而测得紧邻细胞膜的胞外离子变化情况。本研究采用NMT实时记录了小鼠海马脑片神经元Glu引起的跨膜Ca2+内流流速变化;探讨了Aβ31-35对Glu所致细胞的兴奋作用及其机制;利用低钙人工脑脊液观察了跨膜Ca2+的外排过程,并深入探讨了Aβ31-35对Ca2+外排的影响及其可能机制

 

离子/分子流实验处理

海马脑片置于经混合气体饱和后的aCSF中,记录电极三维推进至脑片海马CA1区神经元正上方50 μm处,开启电极移动和电压采集程序,记录神经元在基础状态下2 min内和给予药物处理后5 min期间的Ca2+跨膜流动情况。药物处理包括:

(1)急性给予不同浓度的Glu
(2)急性给予不同浓度的31-35
(3)不同浓度31-35预处理后急性给予Glu
(4)31-35联合D-APV或CNQX预处理后急性给予Glu
(5)急性给予低钙(0.35 mM Ca2+)aCSF液
(6)31-35预处理后给予低钙 aCSF
(7)KB-R7943或TFH预处理后给予低钙aCSF
对照组仅给予溶解药物的溶剂(vehicle)。

 

离子/分子流实验结果

      在基础状态下,海马脑片CA1区神经元未记录到明显的Ca2+内流或外流,这种稳定状态至少可保持到60 min以上(结果未显示)。如图1A所示,作为给药前自身对照,基础状态下2 min内的Ca2+流速平均值接近零水平(0.17±0.1 pmol/(cm2·s))。当分别急性给予不同浓度的Glu后,与对照组(仅给予vehicle)相比,各Glu给药组均即刻检测到快速的内向Ca2+流,流速由起始最大随给药时间延长而逐渐减慢并趋于稳定。经统计学处理,2.5 mM、5 mM、10 mM三个不同浓度的Glu组给药后5 min内的Ca2+流速平均值分别为-177.135±6.528pmol/(cm2·s)、-331.864±22.742 pmol/(cm2·s)和-498.03±55.783 pmol/(cm2·s)。三组不同浓度的Glu给药组之间也存在显著性差异(P<0.05)。这表明,急性给予Glu可浓度依赖性引起海马脑片CA1区神经元跨膜Ca2+内流。有趣的是,急性给予不同浓度的Aβ31-35也诱发了海马脑片神经元出现先快后慢的内向跨膜Ca2+流。如图1C和1D所示,与对照组5 min内Ca2+流速(2.912±2.466 pmol/(cm2·s))相比,10 μM、30 μM和50 μM Aβ31-35组给药后5 min内出现的内向Ca2+流平均流速分别为-32.262±17.347 pmol/(cm2·s)、-129.838±26.610pmol/(cm2·s)和-310.297±35.231 pmol/(cm2·s)。这些内向Ca2+流也具有先快后慢并持续稳定的特征。同时,Aβ31-35诱发的海马脑片CA1区神经元跨膜Ca2+内流具有浓度依赖性(P<0.05)

 

图1. 急性给予Glu及Aβ31-35引起海马脑片CA1区神经元Ca2+内流。负值代表Ca2+内流

 

      如图2A所示,各组脑片在稳定记录2 min基础状态Ca2+流速基础上,除对照组给予vehicle外,其余给药组先用不同浓度的Aβ31-35处理2 min,然后比较各组脑片 急性给予Glu(10 mM)后5 min内的平均Ca2+流速。结果可见,没有Aβ31-35预处理时,Glu引起的平均Ca2+流速为-430.747±37.537 pmol/(cm2·s)(Vehicle+Glu);不同浓度的Aβ31-35预处理2 min后,Glu诱导的内向Ca2+流速较Aβ31-35未预处理组(即单独Glu组)明显增大。10 μM Aβ+Glu组、30 μM Aβ+Glu组和50 μM Aβ+Glu组5 min内Glu诱发的Ca2+流速平均值分别为-1418.91±69.85pmol/(cm2·s)、 -2495.05±127.735 pmol/(cm2·s)、-3887.07±257.969pmol/(cm2·s)。三组之间,内向Ca2+流速也呈现浓度依赖性增强(P<0.001)。这表明,Aβ31-35预处理对Glu诱发海马脑片神经元Ca2+内流具有明显的易化作用

图2. 31-35预处理剂量依赖性增强Glu诱发的海马脑片神经元Ca2+内流。负值代表Ca2+内流

 

      为了检查Aβ31-35对Glu诱发Ca2+内流的易化作用机制,我们比较了单独给予Aβ31-35以及联合给予NMDA受体阻断剂D-APV(100 μM)或AMPA受体阻断剂CNQX(20 μM)预处理的效应。如图3所示,正常对照组(Viehcle+Glu)Glu引起的Ca2+内流平均流速为-571.253±57.129 pmol/(cm2·s);Aβ31-35预处理(Aβ31-35+Glu)可使其易化至-3944.539±340.557pmol/(cm2·s),增加了5倍之多;Aβ31-35联合D-APV(D-APV+Aβ+Glu)后,Glu诱发的Ca2+内流显著减小至-116.345±47.786 pmol/(cm2·s)(P<0.001);而联合给予CNQX(CNQX+Aβ+Glu)后,Glu诱发的Ca2+内流流速仍保持在-3049.358±210.551 pmol/(cm2·s),虽有一定程度减小,但效应明显小于D-APV联合给药组(图3A, B)

图3. NMDA受体阻断剂D-APV逆转了Aβ31-35对海马脑片神经元跨膜Ca2+内流的易化作用。负值代表Ca2+内流

 

      钙稳态的维持不仅涉及到Ca2+内流及其调节,依靠细胞能量系统实现的主动Ca2+外排可能是更重要的另一方面。为此,我们利用NMT检测了海马脑片在低钙 aCSF条件下出现的外向Ca2+流,并探讨了Aβ31-35预处理对Ca2+外排的作用和可能机制。如图4A所示,将电极移至海马记录部位时,正常对照组基础状态下2 min内的Ca2+流速接近零水平,给予vehicle后5 min内Ca2+流速平均值也基本没有变化(0.837±0.499 pmol/(cm2·s))。但将正常aCSF换为低钙(0.35 mM Ca2+)aCSF(Vehicle+Low[Ca2+]o)后,可记录到一个明显的外向Ca2+流,峰值快速达到5186.969±300.595pmol/(cm2·s),随后逐渐回落,5 min时基本稳定在3337.39±231.405 pmol/(cm2·s)上下。统计学处理(图4B)表明,单纯低钙液(Veihcle+Low[Ca2+]o)诱发的Ca2+外排5 min内平均流速为3867.868±244.502 pmol/(cm2·s)。有趣的是,Aβ31-35(50 μM)预处理(Aβ31-35+Low[Ca2+]o)可部分阻断这种 低钙aCSF诱发的Ca2+外排,5 min内平均Ca2+流速只有2541.532±440.146 pmol/(cm2·s)。接着,我们用质膜钙泵阻断剂TFH或质膜钠钙交换体阻断剂KB-R7943分别预处理,以检查这种低钙液诱发的Ca2+外流机制。我们发现,两种阻 断剂在正常aCSF中并不影响基础性的Ca2+流,但用TFH(100 μM)预处理(TFH+Low[Ca2+]o)后,低Ca2+液引起的Ca2+流速较TFH未处理组明显减少,平均流速降低到1954.733±327.616 pmol/(cm2·s);用KB-R7943(100 nM)预处理(KB-R7943+Low[Ca2+]o)后,低Ca2+液引起的Ca2+流则大幅度减少,平均流速只有352.828±75.665 pmol/(cm2·s),抑制程度远大于TFH。这说明,低Ca2+液引起海马脑片CA1区神经元的Ca2+外排主要是质膜上Na+/Ca2+交换体介导的,Na+/Ca2+交换体可能也是Aβ31-35抑制Ca2+外排的主要靶点

图4. 31-35预处理抑制了海马脑片CA1区神经元低钙aCSF诱发的Ca2+外流。负值代表Ca2+内流

 

其他实验结果

  • 腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂可改善3xTg-AD小鼠短期和长期的学习记忆认知行为

  • 腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg 三受体激动剂可减轻3xTg-AD小鼠在体海马CA1区突触可塑性的损害

  • 长期暴露于氧化还原活性Cu(II)-Aβ1-40会导致皮质神经元轴突完整性的进行性改变

  • 腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂可阻止3xTg-AD小鼠海马组织中的S133p-CREB、T286p-CAMKII和S9p-GSK3β的水平下调

 

测试液

120 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3,10 mM D-glucose, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH7.3~7.4

 

结论

      本研究初步表明:长期慢性腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂可显著改善3xTg-AD小鼠的学习记忆行为;三受体激动剂Triagonist同时还改善了3xTg-AD小鼠海马CA1区的突触可塑性;Triagonist处理还提高了上述 3xTg-AD 小鼠海马组 织中与学习记忆功能密切相关的S133p-CREB、T286p-CAMKII和S9p-GSK3β的表达水平。这些结果提示,GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂有可能成为预防和治疗AD尤其是伴有T2DM或血糖异常AD的一种新策略

 

 

 

原文链接:https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&dbname=CMFD201801&filename=1017848874.nh&uniplatform=NZKPT&v=ihL1fGZoKOF6u1oTbGHs7ZYXCR0LdLw8UdnhJ_unZj2_QqoVvj_RJV6GZRGpJ3o9

 

供稿:赵雪琦
编辑:杨爽
校稿:卻彦晗

 

关键词GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂;3xTg-AD学习和记忆长时程增强S133p-CREBT286p-CAMKIIS9p-GSK3β淀粉样β蛋白非损伤微测;跨膜Ca2+;生医动物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

塔斯马尼亚大学:非损伤微测技术发现Cu诱导神经元排K+ 为发现Cu和Aβ相作诱导神经退行性变化提供证据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题:非损伤微测技术发现Cu诱导神经元排K+ 为发现Cu和Aβ相作诱导神经退行性变化提供证据

期刊:Experimental Neurology

标题:Redox-active Cu(II)-Aβ causes substantial changes in axonal integrity in cultured cortical neurons in an oxidative-stress dependent manner

者:塔斯马尼亚大学Roger S. Chung、Claire Howells

 

检测离子/分子指标

K+

 

检测样品

大鼠皮层神经元

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

      β-淀粉样蛋白(Aβ)肽包含表征阿尔茨海默氏病(AD)的淀粉样蛋白斑,并被认为对疾病的发病机理有重大贡献。AD大脑中的氧化应激升高,并且有大量证据表明Aβ和氧化还原活性铜之间的相互作用是导致AD氧化应激的主要因素。这项研究的主要发现是,具有氧化还原活性的Cu(II)–Aβ在长期的神经元培养物中引起明显的轴突病理,包括轴突断裂和过磷酸化tau免疫反应性轴突肿胀的形成。值得注意的是,表达MAP-2的树突过程在很大程度上不受Cu(II)–Aβ处理的影响。这些营养不良的轴突表现类似于AD脑的某些神经炎性病理学特征。本研究表明,Cu(II)–Aβ通过自由基的产生和随后K+从神经元的外排直接导致轴突内肿胀的形成。总之,本研究报道氧化还原活性的Cu(II)–Aβ可以诱导成熟神经元发生实质性的神经退行性变化,并且可能在AD的缓慢进展中起重要作用

 

 

离子/分子流实验处理

40 μM Cu(II)–Aβ实时处理

 

 

离子/分子流实验结果

      研究使用高度敏感的非损伤微测技术来评估Cu(II)-Aβ1-40对培养的皮层神经元K+离子流速的影响(图1)。研究发现,Cu(II)-Aβ1-40引起K+大量外排(图1)。但是Aβ1-40单独对K+流速没有影响(结果未显示)。为了确定Cu(II)-Aβ诱导的K+外流对皮层神经元的重要性,研究评估了K+通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)是否可以阻断Cu(II)-Aβ诱导的细胞骨架破坏。结果发现,4-AP(2 mM)几乎完全阻断了Cu(II)-Aβ诱导的轴内肿胀的形成

 

图1. 40μMCu(II)-Aβ1-40皮层神经元使大量的K+外排。负值代表K+外排。

 

 

其他实验结果

  • Cu(II)-Aβ对培养的皮质神经元的急性毒性比其他生化形式的Aβ毒性更强。

  • 长期暴露于细胞外Cu(II)-Aβ1-40可导致皮质神经元进行性神经退行性变(progressive neurodegeneration)

  • 长期暴露于氧化还原活性Cu(II)-Aβ1-40会导致皮质神经元轴突完整性的进行性改变

  • Cu(II)-1-40导致培养的皮质神经元轴突病理改变。

 

测试液

150 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.5 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 5 mM NaHCO3, 25 mM glucose, pH 7.4

 

 

结论

      本研究报道Cu (Ⅱ) -Aβ可通过氧化应激和K+稳态失调途径诱导神经元发生明显的神经退行性改变,可能在延缓AD的发病机制中发挥重要作用

 

 

 

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0014488612002373

 

供稿:赵雪琦
编辑:杨爽
校稿:卻彦晗

 

关键词神经退变;β -淀粉样蛋白;神经毒性;氧化胁迫;轴突退化;生医动物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

【成果回顾】PCP李银心:NMT发现盐胁迫下磷脂酰丝氨酸合酶促盐角草保K+ 为证明其通过维持质膜和离子稳态提高植物耐盐性提供证据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题:NMT发现盐胁迫下磷脂酰丝氨酸合酶促盐角草保K+ 为证明其通过维持质膜和离子稳态提高植物耐盐性提供证据

期刊:Plant & Cell Physiology

影响因子:4.062

研究使用平台NMT植物耐盐创新平台

标题:Phosphatidylserine Synthase from Salicornia europaea Is Involved in Plant Salt Tolerance by Regulating Plasma Membrane Stability

者:中科院植物所李银心、吕素莲、台方

 

检测离子/分子指标

K+

 

检测样品

盐角草根细胞

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

      盐诱导的脂类改变在许多植物物种中已有报道,然而,脂类生物合成和代谢如何调控,脂类在植物耐盐性中如何发挥作用的研究却少得多。在本研究中,盐角草细胞质膜(PM)中磷脂酰丝氨酸(PS)含量明显高于拟南芥。随后从盐角草中分离到一个编码磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)的基因,命名为SePSS。多重比对和系统发育分析表明,SePSS属于碱基交换型PSS,位于内质网。在400或800 mM NaCl胁迫下,SePSS在盐角草悬浮细胞中的失活导致PS含量降低,细胞存活率降低,PM去极化和K+外排增加。相比之下,SePSS的上调导致拟南芥PS和磷脂酰乙醇胺(PE)水平升高,耐盐性增强,同时转基因株系中活性氧积累比WT低,膜损伤较少,PM去极化较少,K+/Na+较高。这些结果表明,PS水平与植物耐盐性呈正相关,SePSS通过调节PS水平参与植物耐盐性,进而调节PM电位和通透性,维持离子稳态。本研究的工作内容为改善植物在多重胁迫下的生长提供了一个潜在的策略

 

 

离子/分子流实验处理

0、400、800 mM NaCl处理2 h

 

 n

离子/分子流实验结果

      盐胁迫下,植物的PM常常会发生去极化,导致K+从细胞中渗出。为了研究SePSS在盐胁迫下调节膜电位的可能作用,分别用0、400和800 mM NaCl处理空载体(empty vector,EV)细胞和SePSS-RNAi细胞。采用非损伤微测技术(NMT)检测K+净流速,与无盐处理相比,400和800 mM NaCl处理使EV细胞K+内流减少,800 mM NaCl处理使SePSS-RNAi细胞K+由内流转为外排(图1)。这些结果表明,敲除SePSS可能会加剧NaCl诱导的PM去极化,从而导致K+从细胞中渗漏

 

图1. 在不同NaCl浓度下盐角草细胞的净K+流速。正值代表K+外排,负值代K+吸收。

 

 

其他实验结果

  • 盐胁迫下,PM中PS含量增加,盐角草的PS含量明显高于拟南芥

  • SePSS编码一种位于内质网的磷脂酰丝氨酸合成酶

  • 盐处理可诱导SePSS表达

  • 敲除盐角草细胞中的SePSS导致耐盐性降低

  • 过表达SePSS增加了拟南芥PM中PS和PE的表达

  • 过表达SePSS使拟南芥的膜损伤更小,耐盐性更高。

  • 盐胁迫下转基因拟南芥根系PM去极化发生较少。

  • 盐胁迫下转基因拟南芥K+积累增加,Na+积累减少。

 

 

结论

      本研究结果表明,组成性(constitutively)高的PS含量有利于盐角草的耐盐性。SePSS通过调节PS水平参与植物耐盐性。PS含量的增加可以维持PM的去极化和膜的通透性,从而维持PM的稳定性,进而维持盐胁迫下K+/Na+的稳态。考虑到PM的特性,本研究的工作内容可能为改善植物在多重胁迫下的生长提供一个潜在的策略。对可以与PS相互作用的蛋白质的进一步研究将增进本研究对PS在植物耐盐性中的作用的了解。此外,未来研究盐角草对盐胁迫响应的膜脂重塑模式,可为该物种其他脂类的作用及其盐适应机制提供重要的认识

 

 

测试液

0.5 mM KCl, 0.2 mM CaCl2, 2.5% sucrose, pH 5.7

 

 

NMT实验标准化方案

·盐胁迫研究NMT标准化方案

 

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

原文链接:https://doi.org/10.1093/pcp/pcaa141

 

供稿:赵雪琦
编辑:杨爽
校稿:卻彦晗

 

关键词去极化;膜通透性;磷脂酰丝氨酸;质膜;盐角草;盐胁迫;植物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

PPB山师:NMT发现盐胁迫促盐地碱蓬NO3-、H+吸收 为解释盐生植物在低硝高盐条件下吸收和积累NO3-提供依据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题:NMT发现盐胁迫促盐地碱蓬NO3-、H+吸收 为解释盐生植物在低硝高盐条件下吸收和积累NO3-提供依据

期刊:Plant Physiology and Biochemistry

影响因子:4.27

研究使用平台NMT植物耐盐创新平台

标题:The positive effectof salinity on nitrate uptake in Suaeda salsa

者:山东师范大学宋杰、刘冉冉、Bing Cui

 

检测离子/分子指标

NO3-、H+

 

检测样品

盐地碱蓬

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

      硝酸盐在盐生植物的耐盐性中起着营养和渗透双重作用。然而,盐生植物在盐碱条件下如何吸收NO3-仍不清楚。在0.5 mM的NO3--N条件下,用0、200和500 mM的NaCl处理盐地碱蓬幼苗,同时添加或不添加Na3VO4(质膜H+-ATPase抑制剂)处理24 h。200 mM NaCl处理上调了根中硝酸盐转运蛋白2.1(SsNRT2.1)的基因表达,增加了根中H+和NO3-的内流,以及叶和根中15NO3-的积累。SsNRT2.1在200 mM NaCl+Na3VO4处理下的表达量显著高于不加Na3VO4处理,而在叶片和根中15NO3-的积累量则相反。在200mM NaCl下,施加Na3VO4对根系H+净流速无显著影响,但诱导根系NO3-净外排。盐度可直接激活SsNRT2.1的表达,并通过增加PM H+-ATPase泵入H+促进盐地碱蓬对NO3-的吸收,这可能解释了为什么某些盐生植物在低NO3-和高盐度条件下吸收和积累高浓度NO3-的原因

 

 

离子/分子流实验处理方法

①0、200、500 mM NaCl处理1 d。
②0+150 μM Na3VO4、200+150 μM Na3VO4、500 mM NaCl+150 μM Na3VO4处理1 d

 

 

离子/分子流实验结果

与0 mM NaCl相比,200 mM NaCl明显诱导净NO3-内流。然而,500 mM NaCl诱导净NO3-外排(图1a, b)。当加入150 μM Na3VO4时,0、200和500 mM NaCl诱导了NO3-净外排,特别是在500 mM NaCl处理下(图1a, b)。

在0 mM NaCl+0 mM Na3VO4处理下H+外排,在200、500 mM NaCl和0+150 μM Na3VO4200+150 μM Na3VO4500 mM NaCl+150 μM Na3VO4处理时H+内流(图1c, d)。与0 mM NaCl相比,200 mM NaCl显著诱导了H+的内流。与不添加Na3VO4的处理相比,添加150 μM Na3VO4显著诱导了所有NaCl浓度处理下的净H+内流(图1c, d)。

 

 

图1. 不同浓度NaCl和Na3VO4胁迫下盐地碱蓬根系NO3-和H+流速。正值代表H+NO3-外排,负值代H+NO3-吸收。

 

 

其他实验结果

  • 处理24h后,SsNRT2.1在根部的相对表达量随着NaCl浓度的增加而增加,添加Na3VO4会促进其表达量增加。

  • 在不同浓度NaCl处理下,根和叶中15NO3-的积累趋势与SsNRT2.1的相对表达量一致。盐分增加了根和叶中15NO3-的积累,尤其是在200 mM NaCl下。添加Na3VO4降低了根系和叶片中15NO3-的积累

  • 无论Na3VO4怎么处理,盐度对根和地上部分的干重影响较小。添加Na3VO4会显著降低0 mM NaCl处理下根和地上部分的干重。

 

 

结论

      200 mM NaCl增加了盐地碱蓬对NO3-的吸收,这可能是由于PM H+-ATPase增加了H+的泵入。同时,盐度对SsNRT2.1的表达有积极影响。这表明盐度可能直接激活NRT的某些基因,并通过增加PM H+-ATPase对H+的泵送来促进盐生植物盐地碱蓬的NO3-吸收(图2)。这一特性可能解释了为什么盐地碱蓬和其他盐生植物能够在盐度下吸收和积累高浓度的NO3-,即它们能够耐受高盐度,在200~300 mM NaCl下产生最高生物量

 

图2. NaCl对盐地碱蓬NO3-吸收的正效应模型。

 

 

测试液

NO3-:0.5 mM KNO3, 0.1 mM CaCl2, 0.3 mM MES, pH 5.5

H+:0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

 

 

NMT实验标准化方案

·植物营养研究NMT标准化方案

·盐胁迫研究NMT标准化方案

 

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0981942821003788?via%3Dihub

 

供稿:赵雪琦
编辑:杨爽
校稿:卻彦晗

 

关键词盐生植物;硝酸盐转运体;盐分;耐盐性;盐地碱蓬;植物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

巴尔的摩生物医学研究中心:NMT发现谷氨酸促胞内Ca2+浓度↑耗O2量↑ 为证明激活谷氨酸受体会导致细胞内ATP损耗提供证据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题:NMT发现谷氨酸促胞内Ca2+浓度↑耗O2量↑ 为证明激活谷氨酸受体会导致细胞内ATP损耗提供证据

期刊:Journal of Neurochemistry

标题:Simultaneous single neuron recording of O2 consumption, [Ca2+]i and mitochondrial membrane potential in glutamate toxicity

者:巴尔的摩生物医学研究中心Mark P.Mattson、Marc Gleichmann

 

检测离子/分子指标

O2

 

检测样品

皮质神经元

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

      为了确定谷氨酸毒性的细胞过程顺序,研究同时记录了单个皮质神经元的O2消耗量、细胞Ca2+浓度([Ca2+]i)和线粒体膜电位(mΔψ)。使用安培自交铂电极邻近神经元测量耗氧量,其中[Ca2+]i和mΔψ分别用Fluo-4和TMRE+监测,使用旋转盘激光共聚焦显微镜。谷氨酸的兴奋毒性剂量引起[Ca2+]i的升高,随后几秒钟内O2消耗量增加,在1-5分钟内达到最大值。在这段时间内,mΔψ发生了适度的增加,然后,在达到最大O2消耗前不久,mΔψ,如TMRE+荧光所示,消散了。最大O2消耗持续5分钟,然后与mΔψ和ATP水平一起下降,而[Ca2+]i进一步增加。当神经元在[Ca2+]i增加后不久用NMDA受体拮抗剂处理时,mΔψ和[Ca2+]i恢复到基线水平。本研究前所未有的空间和时间分辨率揭示了这一事件序列在所有神经元中是相同的,尽管O2消耗、[Ca2+]i和mΔψ的变化幅度和动力学具有相当大的差异性。使用这种新方法获得的数据与谷氨酸受体激活后几分钟,尽管线粒体呼吸达到最大,但Ca2+内流导致ATP耗竭的模型一致

 

 

离子/分子流实验处理方法

培养14天的皮质神经元
950 ng/mL寡酶素
10 μM 鱼藤酮
100 nM~1 μM FCCP
1~32 μM谷氨酸

 

 

离子/分子流实验结果

在最初的一系列实验中,在从神经元簇中记录到稳定的耗氧量后,施加寡霉素阻断线粒体ATP的合成。耗氧量至基础水平的21.8±2.1%(图1c),进一步添加鱼藤酮[阻断电子传输链复合物I(ETC)],耗氧量降至11.8 %±2.1%(图1c)。这一结果表明,大脑皮层神经元平均88.2%的氧消耗需要用来驱动ETC,但只有78.2%需要用来产生ATP。10%的差异很可能用于线粒体解偶联和钙缓冲。因此,剩余的11.8%的神经元耗氧量与ETC无关,可能包括其他氧库,如过氧化物酶体或额外的耗氧反应(如线粒体的解毒)。

研究接下来测量单个神经元的氧消耗(图1d)。加入寡霉素后单个神经元的氧消耗下降速度比神经元团簇快,很可能反映了寡霉素进入整个神经元的扩散速度更快。单个神经元通常具有1~5 pmol cm-2s-1的O2流速,这似乎与神经元的大小有关(较大的神经元表现出较高的O2消耗速率)。

 

图1. 单个神经元(c)和神经元簇(d)中的耗氧量。添加寡霉素和鱼藤酮后的稳定阶段用橙色条表示,这段时间的平均流速值在下面。bck表示记录在神经元层上方400 μm处的背景信号,在该区域没有O2流速。黑线表示时间刻度正值代表O2吸收

 

为了评估神经元的最大呼吸能力,在加入浓度逐渐增加的解偶联剂FCCP后,测量耗氧量(图2a和b)。引起最大耗氧量的FCCP的最佳剂量在单个神经元之间差异很大,范围从100 nM到1 μM。诱导的最大耗氧量,只能维持5 min左右或更短的时间,随后5~30 min内逐渐下降至或接近零(图2a和b)。FCCP浓度的增加(高于诱导最大耗氧量所需的浓度)缩短了最大耗氧量持续的时间,加速了之后的下降。

谷氨酸浓度的增加导致耗氧量的增加(图2c和d)。引起最大响应的浓度范围,神经元簇为10~32 μM,单个神经元为7~32 μM。持续的氧消耗在神经元簇中持续长达10 min,在单个神经元中持续1~5 min。单个神经元的耗氧量通常比神经元簇中的耗氧量下降得更快,这表明对神经元群体的检测结果使群体内单个神经元对谷氨酸的耗氧反应所持续时间被高估。谷氨酸浓度的进一步增加不会导致耗氧量的进一步增加。平均而言,谷氨酸使神经元簇中耗氧量增加至对照组的213±35%(图2和g)。因此,由谷氨酸诱导的耗氧量增加的幅度与由FCCP诱导的增加相似。以单一(最佳)剂量而不是逐步增加剂量施加谷氨酸会导致相同的反应。

为了确定谷氨酸确实可以诱导神经元中最大的耗氧量,在谷氨酸后不久加入FCCP。随后添加的FCCP不会引起氧消耗的进一步增加(图2e, f)。在这一系列实验中,仅谷氨酸使耗氧量比基础水平增加了250±22%,随后添加FCCP则没有其他作用(基础水平为247±47%;图2h)。如果与之前发表的小脑颗粒神经元结果相比,本研究的数据表明皮质神经元需要更低剂量的谷氨酸才能达到最大呼吸水平(皮层神经元33 μM,小脑神经元100 μM),这与皮质神经元对谷氨酸毒性的敏感性更高相一致。小脑颗粒细胞在人工脑脊液(ACSF)中的最大呼吸作用比基础值高250~275%,略高于皮质神经元,可能与小脑颗粒细胞对兴奋性毒性的抵抗有关。

 

图2. FCCP和谷氨酸引起皮质神经元最大的O2流速。添加FCCP(a+b)、谷氨酸(c+d)和FCCP后加谷氨酸(e+f)处理下神经元簇(a、c和e)和单个神经元(b、d和f)中O2流速的动态记录。添加的药物和浓度用棕色(FCCP)和红色(谷氨酸)线表示。时间刻度用黑线表示,bckg表示背景信号。FCCP和谷氨酸处理后O2流速的平均值和峰值(g、h、i、j)。正值代表O2吸收

 

 

测试液

120 mM NaCl, 3.1 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 20 mM Tris, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaSO4, 1.3 mM CaCl2,15 mM glucose, pH 7.4

 

 

文章简介

神经元是可兴奋性细胞,在突触活动及产生动作电位后,神经元要产生大量的ATP驱动离子泵以提高胞内的Na+和Ca2+水平。谷氨酸(Glu)是重要的神经递质,负责快速突触传递及突触传递强度的长期变化,并参与认知和记忆等过程;但如果过度激活谷氨酸受体,谷氨酸会导致离子平衡破坏、细胞死亡等毒性反应。本文为明确谷氨酸神经毒性的机制,将非损伤微测技术与激光共聚焦技术结合,以大鼠幼崽大脑皮层的神经元为被测样品,用非损伤微测技术检测单个神经元O2消耗量(即O2内流),而用激光共聚焦技术检测其胞内Ca2+浓度和线粒体膜电位。研究发现,在谷氨酸作用下,细胞内Ca2+浓度上升,随后O2消耗量增加,这期间线粒体膜电位也发生相应改变。该结论直接证实了下述谷氨酸毒性机理模型:谷氨酸受体被激活后能引起Ca2+内流,导致细胞内ATP损耗。
将非损伤微测技术与激光共聚焦等技术相结合,检测生物样品内部和外部离子分子或其他信息的变化情况,已经成为揭示生命过程机理机制的重要手段。

 

 

 

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19226367/

 

供稿:赵雪琦
编辑:杨爽
校稿:卻彦晗