东农王傲雪、陈秀玲：NMT发现病原菌侵染时atpA促叶肉排H+排Ca2+利于植物维持光合作用和信号转导提升抗性

        叶绿体ATP合成酶（cpATPase）负责光合作用过程中产生ATP。作者前期的研究表明，cpATPase CF1α亚基（AtpA）是参与粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）诱导番茄灰霉菌（Botrytiscinerea）抗性的关键蛋白。本研究结果显示番茄cpATPase CF1α亚基基因（atpA）的表达水平被灰霉菌和粉红粘帚霉上调。然后分离番茄atpA基因，并获得转基因烟草株系。与未转化植株相比，过表达atpA的烟草对灰霉菌的抗性增强，表现为病害发生率降低、防御相关超敏反应（hypersensitive response, HR）样反应、活性氧平衡、叶绿体超微结构损伤减轻、ATP含量和cpATPase活性升高、碳代谢、光合作用和防御相关基因表达增强。转基因烟草接种灰霉菌后，Ca²⁺外排增加，H⁺外排稳定。此外，atpA基因的过表达增强了对盐分的耐受性和对番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）抗性。因此，cpATPase的α亚基是介导细胞氧化还原稳态、ATP生物合成和抗性性状基因表达的关键调节因子，在植物产生广谱抗性的过程中调节机体对病原菌的免疫。

离子/分子流实验处理

以1月龄WT和转基因烟草的第3片成熟叶片为材料，灰霉菌悬浮液侵染0 h、0.5 h和3 h（hpi）。

        使用非损伤微测技术（NMT）研究烟草叶片（距植株顶部第3个叶片）叶肉细胞Ca²⁺和H⁺流速的动态变化。Ca²⁺在正常条件下表现为轻微外排，WT与转基因烟草植株之间无明显区别。与WT相比，0.5 hpi时转基因烟草的Ca²⁺外排速率下降较快，而3 hpi时转基因烟草的Ca²⁺外排速率明显大于WT（图1A, B, C）。在正常生长条件下，WT中H⁺外排略高于转基因烟草。灰霉菌侵染后，0.5 hpi时转基因植株体内H⁺外排速率略有增加，但烟草植株间差异不显著。可见，转基因株系的H⁺外排在整个灰霉菌侵染期间保持稳定，而WT在3 hpi时有明显的下降趋势（图1D, E, F）。

图1. 烟草野生型（WT）和转基因株系（OE17和OE30）叶肉细胞对灰霉菌不同时间的实时净Ca²⁺（A, B, C）和H⁺（D, E, F）流速响应。注：（A, D）用缓冲液（模拟接种处理）处理烟株，(B, E）用灰霉病菌处理0.5 hpi，（C, F）用灰霉病菌处理3 hpi。

图2. 叶肉细胞检测图

其它实验结果

• atpA cDNA全长1524 bp，与叶绿体基因组序列相比，有一个单核苷酸突变（T674→C674）。

• 通过卡那霉素筛选培养基、PCR和qRT-PCR方法筛选出atpA表达量较高的3个atpA过表达株系，分别是OE17、OE21和OE30。

• 灰霉菌处理的WT烟草植株在7 dpi时症状严重，有明显的病斑，转基因烟草叶片伤口部位周围无明显症状或褐变范围较小。30 dpi时，WT叶片黄化枯萎，而OE17、OE21和OE30叶片的坏死面积均小于野生型，表明OE17、OE21和OE30叶片的坏死面积受atpA过表达的控制。

• 与WT相比，所有atpA过表达烟草的灰霉病症状均显著降低。过表达atpA显著降低了灰霉菌侵染烟草植株的病情指数和发病率。

• atpA过表达稳定了灰霉菌侵染下的叶绿体结构。

• 12~48 hpi期间，OE17、OE21、OE30的叶绿素a和叶绿素b含量均高于WT。

• CAT活性在所有烟草植物的3 hpi之前增加，OE17、OE21和OE30的CAT活性超过WT；转基因株系的SOD在24、48和96 hpi时高于WT；在所有烟草中，POD活性先是下降，但到96 hpi时又上升，转基因系的POD活性在96 hpi达到最大值；3种转基因株系的苯丙氨酸酶（PAL）活性在6和96 hpi时显著提高。

• 转基因株系在全株侵染期间F1F0-ATPase活性高于WT。

• 转基因株系与WT之间H₂O₂含量在3 hpi时差异最大；转基因株系的NO水平和O₂^-水平始终高于WT。

• 植物在真菌侵染的不同阶段已经进化出一系列的防御机制，而灰霉菌侵染可导致atpA介导的许多代谢途径的改变。

• 转基因烟草在盐胁迫下表现出明显优于WT的种子发芽率和幼苗生长。此外，对WT和转基因烟草植株喷洒孢子悬浮液，发现转基因烟草对番茄叶霉病的抗性增加。

        本研究结果表明，与野生型烟草相比，过表达atpA正调节植物对灰霉菌的抗性，这是由ROS的平衡、氧化损伤减少和光合作用效率提高所推断的。在病原菌感染初期，过表达关键atpA基因可以调控植物—病原物互作相关基因以及光合相关和代谢相关基因的表达。此外，atpA过表达同时提高了植物的耐盐性和对番茄叶霉病抗性，表明其具有诱导广谱防御的能力。

测试液

NH₄⁺：2.5 mM CaCl₂, 1.5mM K₂SO₄, 0.6 mM Na₂HPO₄, 0.25 mM MgSO₄, 4 mM (NH₄)₂SO₄, pH 4.0

NO₃^-：2.5 mM CaCl₂, 1.5mM K₂SO₄, 0.6 mM Na₂HPO₄, 0.25 mM MgSO₄, 8 mM NaNO₃, pH 4.0

仪器采购信息

• 据中关村NMT产业联盟了解，东北农业大学于2018年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

文章原文：http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO-06-20-0242-R

关键词：cpATPase α亚基；ATP；番茄；广谱抗性；灰霉菌抗性